이 연구의 목적은 정상적인 췌장 생물학과 질병 발달 모두에서 췌장 혈관 구조의 역할에 대한 이해를 심화하는 것입니다. 내피 분획을 성공적으로 농축함으로써, 우리는 췌장 기능을 관장하는 혈관 구조 내의 특정 경로를 식별하고자 하며, 이는 질병 환경에서 췌장 기능을 회복하고 향상시키기 위해 잠재적으로 표적이 될 수 있습니다. 최근에는 췌장 병리학에서 내피 세포 기능 장애의 역할이 점점 더 강조되고 있습니다.
췌장에서 내피 세포 집단의 이질성을 확인함으로써 내피 췌장 상호 작용이 질병에 대해 어떻게 노력하거나 보호하는지 이해할 수 있게 되었습니다. 단세포 또는 단핵 RNA 염기서열분석, 단백질체학 및 유전체학(genomics)과 같은 오믹스(Omics) 접근법은 세포 수준에서 췌장을 연구하는 데 사용되고 있습니다. 조직 또는 공간 수준에서 통찰력을 얻기 위해 Visium 및 Xenium과 같은 편향되지 않은 프로브 기반 접근 방식을 사용하는 새로운 플랫폼이 구현되고 있습니다.
이 프로토콜에서는 세포 생존력 감소로부터 내인성 췌장 효소를 최소화하는 부드러운 해리 기술과 내피 세포를 선택적으로 농축하기 위한 자기 세포 분류 절차에 대해 설명합니다. 당사 프로토콜의 dissociation and enrichment 전략을 통해 기술적 한계로 인해 이전에 연구되지 않았던 췌장 내피 세포의 세포 표면 마커와 전사체에 대한 추가 이해를 가능하게 할 것입니다. 시작하려면 안락사된 마우스를 수술대에 놓습니다.
마우스 팔다리를 펴고 핀으로 고정합니다. 수술용 가위를 사용하여 하복부에서 피부와 복막을 통해 흉부 부위로 뻗어 나가는 작은 정중선 절개를 만듭니다. 횡격막을 절단하고 흉곽을 들어 올려 심장을 노출시킵니다.
얼음처럼 차가운 멸균 PBS가 들어 있는 주사기에 연결된 25-30 게이지 바늘을 심장의 좌심실에 삽입합니다. 분당 5-10ml의 속도로 심장을 관류하고 10ml를 주입한 후 멈춥니다. 그런 다음 해부 가위와 집게를 사용하여 췌장을 조심스럽게 추출합니다.
트립신 억제제와 함께 10ml의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 50ml 튜브에 췌장을 옮기고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 시작하려면 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 페트리 접시에서 쥐의 췌장을 얻습니다. 수술용 가위와 핀셋을 사용하여 여분의 조직을 조심스럽게 제거합니다.
트리밍된 췌장을 1ml의 해리 용액이 들어 있는 5ml 튜브로 옮깁니다. 해부 가위로 췌장 조직을 미세한 조각으로 다져 튜브를 얼음 위에 유지합니다. 얼음 위에 놓인 50ml 튜브에 용해물을 옮깁니다.
5ml 튜브에 2ml의 콜라겐분해효소 용액을 추가하여 잔여 췌장 조직을 제거하고 50ml 튜브로 옮깁니다. 섭씨 37도에서 템퍼링된 수조에서 20분 동안 튜브를 배양합니다. 조직 균질이 있는 튜브를 얼음 위에 놓고 중력에 의해 가라앉히십시오.
그런 다음 상층액을 70마이크로미터 필터에 통과시키고 5ml의 해리 정지 용액을 추가합니다. 27 게이지 바늘을 사용하여 남은 펠릿을 1ml의 해리 용액으로 분쇄하고 이전과 같이 필터를 통과시킵니다. 세포 현탁액을 300G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 회전시키고 펠릿을 1ml의 세척 버퍼에 재현탁합니다.
1 마이크로 리터의 항 CD31 비오틴 항체를 회전체에서 7 개의 세포의 힘으로 1 곱하기 1 배양하십시오. 20마이크로리터의 항비오틴 MicroBeads를 넣고 40분 더 배양합니다. 그런 다음 컬럼 분리기 홀더가 있는 마그네틱 스탠드를 설정하고 컬럼을 적용합니다.
컬럼을 평형화한 후 샘플을 컬럼에 추가하고 총 9ml의 세척 버퍼로 세척합니다. 홀더에서 컬럼을 제거하고 15ml 튜브에 넣습니다. 컬럼에 5ml의 세척 버퍼를 추가합니다.
플런저를 사용하여 컬럼의 세포를 아래로 눌러 내피 세포를 포함하는 용리액을 수집합니다. 마지막으로, flow-through 및 elution fractions를 스핀다운합니다. 재현탁 후 세포를 계수하고 생존력을 측정합니다.
내피 세포의 농축을 검증하기 위한 정량적 PCR 분석은 농축된 분획이 플로우 스루 샘플에 비해 마커 유전자, Pecam1 및 Kdr 수치가 훨씬 더 높은 것으로 나타났습니다. 췌장 내분비 세포의 전사 인자인 NK6 호메오박스 1의 낮은 수치가 농축 분획에서 관찰되었습니다. 웨스턴 블로팅(western blotting)은 예상 크기에서 CD31의 강력한 신호를 보여주었으며, 이는 분획의 내피 세포 농축을 더욱 확증했습니다.
