睾丸融合的显微外科梗阻

摘要

将铝箔显微外科插入 Spodoptera litura 的睾丸之间，以阻碍睾丸的融合。该过程包括冷冻，固定，消毒，切口，放置屏障，缝合，术后喂养和检查。这种方法提供了一种干扰组织形成的方法。

摘要

没有使用RNA干扰（RNAi）和簇状规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）/ CRISPR相关的核酸内切酶Cas9等遗传方法，而是在 Spodoptera litura 的睾丸之间插入物理屏障，以研究这种显微手术对其生长和繁殖的影响。在睾丸之间插入铝箔后，昆虫在变质过程中的蜕皮正常进行。昆虫的生长和发育没有显着改变;然而，如果显微外科手术停止睾丸融合，精子束的数量就会发生变化。这些发现表明，阻断睾丸融合会影响男性生殖能力。该方法可进一步应用于中断器官之间的通信，以研究特定信号通路的功能。与传统手术相比，显微外科手术只需要冷冻麻醉，比二氧化碳麻醉更可取。显微外科手术还可以最大限度地减少手术部位区域并促进伤口愈合。但是，具有特定功能的材料的选择需要进一步研究。在手术过程中做切口时，避免组织损伤至关重要。

引言

融合是组织或器官发育中的常见现象。例子包括 果蝇¹中的背侧闭合和胸部闭合以及小鼠和鸡的腭形态发生，神经管形态发生以及心脏形态发生²。CRISPR和RNAi已被应用于研究基因在融合过程中的作用^2，3，4。

Spodoptera litura（S. litura，鳞翅目: Noctuidae）是一种有害的多食性害虫，广泛分布在亚洲的热带和亚热带地区，包括中国^4，5，6。 S. litura 的广泛分布部分归因于其强大的生殖能力，这与性腺发育有关。男性不育症是控制这种害虫的一种方法。如睾丸结构示意图所示，睾丸被睾丸鞘包围，包括外鞘（腹膜鞘）和内基底层。基底层向内延伸以形成滤泡上皮，并将睾丸的内部区域分成四个称为卵泡的腔室（图1）。

在卵泡中，精子形成有丝分裂和减数分裂后发育成精子，然后精子囊中的精子朝同一方向排列形成精子束⁷。在精子发生过程中，初级精子细胞分化为真芘精子或芘精子。幼虫期的精子细胞发育成真芘精子，长尾巴连接到细长的细胞核的头部;这些可以使卵子受精。相反，蛹中期的精子细胞发育成具有废弃细胞核的芘精子;这些精子有助于芘啉精子的存活、运动和受精^9，10。蛹^的第 6天是睾丸具有丰富的真芘和芘精子束的时期。

图 1:鳞翅目昆虫睾丸结构示意图¹¹。请单击此处查看此图的放大版本。

睾丸融合发生在鳞翅目^{的大多数昆虫11，12}中，特别是在那些农业害虫中。睾丸融合是指一对睾丸在幼虫期双侧生长，彼此接近并粘附，最终整合成单个性腺¹¹。在 Spodoptera litura 中 ，它发生在从幼虫到蛹阶段的过程中。从5龄（L5D1）^的第 1天到6龄（L6D4）^的第 4天，这对睾丸的大小逐渐增长，颜色从象牙白色变为浅黄色。当它到达前期（L6D5至L6D6）时，它会变成淡红色。两个双侧对称睾丸在前裆阶段相互接近，融合为一个，逆时针扭曲（多拉视图），在蛹期和成虫期产生单个睾丸¹¹。这种现象不会发生在蚕身上，蚕具有相当大的经济重要性，并且已经驯化了5000年¹³。因此，假设睾丸的融合提高了生殖能力。

为了确定 踞 踤荠睾融合术的意义，重要的是要研究阻断该过程的影响。在该协议中，在睾丸之间微外科插入铝箔以保持它们分离，并研究了昆虫及其睾丸发育的相应变化。

研究方案

1. 昆虫饲养与维护

1. 用人工饲料在环境模拟室中培养 Spodoptera litura 幼虫，直到它们到达^6龄 （L6D4）的第4天。当蠕虫进入⁶ 龄（L6D0）的第一天时，根据八腹的三角形反三角形结构选择雄性幼虫¹⁴。
   注:幼体饲养和保养技术以前发表过^4，14。

2. 术前准备

1. 将铝箔修剪成带有圆角的矩形片（1 mm x 2 mm， 图2）。
2. 通过在手术平台和相关物品（桌子表面，显微镜，冰箱，昆虫盒，蜡盘，别针和线）表面喷洒75%酒精并将其擦拭来消毒。
3. 用高压蒸汽灭菌器对手术工具（包括铝箔）灭菌30分钟，并将其置于120°C的加热和干燥烤箱中。
4. 确保操作人员穿戴干净的实验室服装、外科口罩和无菌手套。

3. 在睾丸之间放置屏障的显微外科手术

注:一般工作流程如下:冷冻→固定→消毒→切口→屏障放置→缝合→术后喂养和检查

1. 将雄性幼虫（L6D4）放在冰上10-30分钟，以使其在手术过程中麻醉。
2. 将幼虫放在蜡盘上，背侧朝上，然后用销和线固定幼虫的头部和尾部，显示^第 9个身体节段背表面的手术区域（图3A）。
3. 通过将3%碘酊剂与棉签涂在表皮（^第 9体段）上来消毒手术区域，然后用70%酒精除去碘（图3B）。
   注意:通过手术显微镜的粗略和微调聚焦于幼虫（图3C）。将蜡盘放在装满冰块的较大培养皿上以保持麻醉。
4. ^在第9个身体节段的背表皮上做一个2毫米长的切口。接下来，使用无菌棉签去除任何泄漏的血淋巴和脂肪体，并获得手术区域的清晰视图。
   注意:在手术过程中避免心脏是很重要的。这可以通过在第9个身体节段的中线旁边或^{在第9和第}10个身体节段之间的关节处做切口，以防止睾丸由于幼虫内部压力而弹出来完成。使用手术刀时，首先用刀片做一个垂直的切口（图4A），然后将其朝向表皮转动45°，然后均匀连续地切开表皮（图4B）。
5. 使用手术镊子在睾丸之间插入一块铝箔（图5）。
6. 在手术结束时，关闭切口以避免感染，并让幼虫从手术中恢复过来。
   1. 用运行缝合线闭合表皮（图6）。
   2. 使用针头支架和手术镊子打一个手术方形结，需要两个相对的镜像简单结（图6D，E）。
   3. 使用剪刀从环尾剪下多余的缝合线，留下2毫米的线。
7. 缝合后，轻轻地将幼虫放在饲养箱中，并将它们保持在干净的环境模拟室中。继续观察幼虫。
   注意:伤口停止漏血淋巴，幼虫在手术后逐渐恢复。蠕虫继续完成它们的蜕变。

图 2:使用铝箔 （1 mm x 2 mm） 制备的物理屏障。请单击此处查看此图的大图。

图3:切口前。 （A）固定幼虫。（B）手术区域表皮消毒。（三）在显微镜下进行手术。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4:切口 （A）用刀片垂直切开幼虫。（B）在切开之前将刀片朝向表皮转动45°。 请点击此处查看此图的放大版本。

图5:在睾丸之间插入物理屏障（铝箔）。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 6:缝合。 （A） 插入针头。（B）拔出针头。（三）拔出并夹住针头。（D）打第一个简单的结。（E）系住相对的镜像简单结。（F）切掉多余的缝合线。 请点击此处查看此图的放大版本。

结果

显微外科手术对鳞翅目生长发育的影响
显微手术在背侧幼虫表皮上留下了2毫米长的伤口，最终停止了血淋巴泄漏并愈合。幼虫经过前期和蛹期并关闭，表明显微手术对生长发育没有重大影响。当幼虫蜕皮成蛹时，缝合线与表皮一起被丢弃。接受手术和未接受手术的蛹的外观没有明显差异。在关闭后，成年雌性成功地与先前手术的成年雄配，导致受?...

讨论

在 对Spodoptera litura的睾丸融合进行显微外科手术后，精子束的数量减少，这支持了这种融合有利于生殖能力的假设。自20^世纪初 以来，外科手术一直被用于研究昆虫的生理发育。为了确定颅神经是否受到昆虫的调节，一些研究人员对不同的昆虫（包括半翅目 Rhodnius prolixus ，鳞翅目中的 Lymantria dispar ）进行了结扎和斩首等程序 ^{15 ，}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
75% Rubbing alcohol	Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd	Q/370285HNW 001-2019
Colored Push Pins	Deli Group Co.,LTD	0042
Corneal Scissors	Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd	MR-S221A	Curved and blunt tip
Glad Aluminum Foil	Clorox China(Guangzhou) Limited	831457	10 cm*2.5 cm*0.6
Medical Cotton Swabs (Sterile)	Winner Medical Co., Ltd.	601-022921-01
Medical Iodine Cotton Swab	Winner Medical Co., Ltd.	608-000247
Needle holder	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.	J32030	14 cm fine needle
Sterile surgical blade	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD	#11
Suigical Blade Holder	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD	K6-10	Straight 3#
Suture thread with needle	Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd		needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm
Tying Forceps	Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd	MR-F201T-3	Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head