鞘翅目典礼における精巣融合の顕微外科的閉塞

要約

アルミニウム箔は、精巣の融合を妨げるために 、Spodoptera litura の精巣の間に微小外科的に挿入された。この手順には、凍結、固定、消毒、切開、バリアの配置、縫合、術後の摂食、および検査が含まれる。このアプローチは、組織形成を妨害する方法を提供する。

要約

RNA干渉(RNAi)のような遺伝的方法や、規則正しく間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)/CRISPR関連エンドヌクレアーゼCas9などの遺伝的方法を使用する代わりに、物理的な障壁を Spodoptera litura の精巣間に微小外科的に挿入し、この微小手術がその成長と生殖に及ぼす影響を研究した。精巣間にアルミ箔を挿入した後、変態中の昆虫の脱皮は正常に進行した。昆虫の成長と発達は著しく変化しなかった。しかし、精巣融合が顕微手術によって停止された場合、精子束の数は変化した。この新知見は、精巣融合を遮断することが男性の生殖能力に影響を与える可能性があることを示唆している。この方法は、特定のシグナル伝達経路の機能を研究するために、器官間の通信を遮断するためにさらに適用することができる。従来の手術と比較して、マイクロサージャリーは凍結麻酔のみを必要とし、二酸化炭素麻酔よりも好ましい。マイクロサージャリーはまた、手術部位面積を最小限に抑え、創傷治癒を促進する。しかし、特定の機能を持つ材料の選択は、さらなる調査が必要です。組織損傷を避けることは、手術中に切開を行う際に重要です。

概要

融合は、組織または器官の発達における一般的な現象である。例としては、ショウジョウバエ¹および口蓋形態形成における背部閉鎖および胸郭閉鎖、マウスおよびニワトリにおける神経管形態形成、ならびに心臓形態形成²が含まれる。CRISPRとRNAiは、融合の過程における遺伝子の役割を調べるために応用されています^2,3,4。

スポドプテラ・リチュラ(S. litura, 鱗翅目: Noctuidae)は、中国を含むアジアの熱帯および亜熱帯地域に広く分布している有害な多食性害虫である^4,5,6。S. lituraの広い分布は、生殖腺の発達に関連するその強力な生殖能力に部分的に起因しています。男性不妊症は、この害虫を防除するための1つのアプローチです。精巣構造の模式図に示すように、精巣は精巣鞘によって囲まれ、外鞘(腹膜鞘)および内側基底薄板を含む。基底薄層は内部に伸びて濾胞上皮を形成し、精巣の内側領域を卵胞という名前の4つのチャンバーに分離する(図1)。

卵胞では、精子は有糸分裂と減数分裂の後に精子に発達し、精子嚢内の精子は同じ方向に整列して精子束を形成します⁷。精子形成の間、初代精子細胞はユーピレン精子またはアピレン精子に分化する。幼虫期の精子細胞は、細長い核の頭部に接続された長い尾を有するユーピレン精子に発達する。これらは卵を受精させることができます。逆に、蛹期半ばの精子細胞は、廃棄された核を有するアピレン精子に発達する。これらの精子は、ユーピレン精子の生存、運動、受精を助ける^9,10。蛹の6^日目は、精巣が豊富なユーピレンとアピレンの精子束を有する期間である。

図1:鱗翅目昆虫の精巣構造の模式図¹¹。この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。

精巣融合は、鱗翅目秩序のほとんどの昆虫^11,12、特に農業害虫である種において起こる。精巣融合は、幼虫期に両側に成長し、互いに接近して接着し、最終的に単一の生殖腺¹¹に統合する一対の精巣を指す。スポドプテラ・リチュラでは、幼虫から蛹期への変態中に起こる。⁵齢(L5D1)の1日目から6齢⁽L6D4)の4日目まで、精巣のペアは徐々にサイズが大きくなり、色は象牙白色から淡黄色に変わります。蛹期(L6D5~L6D6)に達するとかすかな赤色になります。2つの両側対称精巣は、蛹準備段階で互いに接近し、1つに融合し、反時計回り(肩面図)にねじれて、蛹期と成虫期に単一の精巣を生成する¹¹。この現象は、経済的にかなり重要であり、5000年間家畜化されてきたカイコでは発生しません¹³。したがって、精巣の融合は生殖能力を改善すると仮定される。

Spodoptera litura testicular fusionの重要性を決定するには、このプロセスをブロックする効果を調べることが重要です。このプロトコルでは、精巣の間にアルミニウム箔を微小外科的に挿入して分離させ、その結果として昆虫および精巣の発生の変化を研究した。

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プロトコル

1. 昆虫の飼育と維持管理

1. スポドプテラ典礼幼虫を人工食を用いた環境シミュレーションチャンバーで^、6齢(L6D4)の4日目に達するまで培養する。ワームが第6齢(L6D0)の初日に入ったときに^、第8腹部の逆三角形の構造に基づいて雄幼虫を選択します¹⁴。
   注:幼虫の飼育と維持技術は以前に公開されました^4,14。

2. 手術前準備

1. アルミ箔を角が丸みを帯びた長方形にトリミングします(1 mm x 2 mm、 図2)。
2. 手術台および関連アイテム(テーブル表面、顕微鏡、アイスボックス、昆虫ボックス、ワックストレイ、ピン、糸)を、その表面に75%アルコールを噴霧し、拭き取って滅菌する。
3. 手術器具(アルミ箔を含む)を高圧蒸気滅菌器で30分間滅菌し、120°Cの加熱乾燥オーブンに入れます。
4. オペレータは、清潔な実験服、手術用マスク、滅菌手袋を着用してください。

3.精巣間の障壁の顕微手術的配置

注:一般的なワークフローは次のとおりです:凍結→固定→消毒→切開→バリア配置→縫合→術後の給餌および検査

1. 雄の幼虫(L6D4)を氷の上に10〜30分間置き、手術中に麻酔をかけたままにします。
2. 背側を上にしてワックストレイに幼虫を置き、幼虫の頭部と尾部をピンと糸で固定し、9^番目の 体セグメントの背側表面である手術領域を示す(図3A)。
3. 表皮に綿棒で3%ヨウ素チンキを塗布して手術領域を消毒し(9^番目の 体セグメント)、続いて70%アルコールを適用してヨウ素を除去します(図3B)。
   注:手術用顕微鏡の粗い微調整を通して幼虫に焦点を合わせます(図3C)。ワックストレイを氷で満たされた大きな培養皿の上に置き、麻酔を保つ。
4. ^第9体節の背側表皮に長さ2mmの切開を行う。次に、滅菌綿棒を使用して、漏れている血リンパ液および脂肪体を除去し、手術領域の明確な視界を得る。
   注:手順中に心臓を避けることが重要です。これは、幼虫の内圧のために精巣が飛び出すのを防ぐために、第9の身体セグメントの中間線のわずかに隣^{り、または第9}および^第10の身体セグメントの間の関節で切開を行うことによって行うことができる。メスを使用しながら、まず刃で縦スリットを作り(図4A)、次に表皮に向かって45°回してから、表皮を均等かつ連続的に切断します(図4B)。
5. 手術用ピンセットを使用して、精巣の間にアルミホイルを挿入します(図5)。
6. 手術の終わりに、感染を避けるために切開部を閉じ、幼虫が手術から回復するのを許す。
   1. ランニング縫合糸で表皮を閉じます(図6)。
   2. ニードルホルダーと外科用ピンセットを使用して外科用正方形の結び目を結び、2つの対向する鏡像の単純な結び目が必要です(図6D、E)。
   3. はさみを使用してループテールから余分な縫合糸を切断し、2mmの糸を残します。
7. 縫合後、幼虫を飼育箱に静かに敷き詰め、清潔な環境シミュレーションチャンバーに保管してください。幼虫を観察し続ける。
   注:創傷は血リンパ液の漏れを止め、幼虫は手術後に徐々に回復する。ワームは変態を完了し続けます。

図 2: アルミ箔 (1 mm x 2 mm) を使用して作成した物理的な障壁。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:切開前 (A)幼虫を固定する。(B)手術領域の表皮の消毒。(ハ)顕微鏡下で手術を行う。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:切開 (A)幼虫を刃で垂直にスリットする。(B)切り裂く前に刃を表皮に向かって45°回します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:精巣間に物理的な障壁(アルミニウム箔)を挿入する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:縫合。 (A)針を挿入します。(B)針を抜く。(C)針を引っ込めて締め付けます。(D)最初の単純な結び目を結びます。(E)対向する鏡像の単純な結び目を結びます。(F)余分な縫合糸を切る。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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結果

鞘翅目典礼の成長と発達に対するマイクロサージャリーの影響
マイクロサージャリーは背側幼虫表皮に長さ2mmの傷を残し、最終的に血リンパ液の漏出を止めて治癒した。幼虫は蛹前期と蛹期を経て閉鎖され、マイクロサージャリーが成長と発達に大きな影響を及ぼさなかったことを示している。幼虫が蛹に脱皮したとき、縫合糸は表皮とともに...

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ディスカッション

Spodoptera lituraの精巣融合を微小外科的に妨害した後、精子束の数は減少し、この融合が生殖能力に有益であるという仮説を支持した。外科的操作は、20^世紀初頭以来、昆虫の生理学的発達を研究するために使用されてきた。脳神経が昆虫の変態によって調節されているかどうかを判断するために、一部の研究者は、異なる昆虫(半翅目のロドニウス・プロリクサス、鱗翅目...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
75% Rubbing alcohol	Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd	Q/370285HNW 001-2019
Colored Push Pins	Deli Group Co.,LTD	0042
Corneal Scissors	Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd	MR-S221A	Curved and blunt tip
Glad Aluminum Foil	Clorox China(Guangzhou) Limited	831457	10 cm*2.5 cm*0.6
Medical Cotton Swabs (Sterile)	Winner Medical Co., Ltd.	601-022921-01
Medical Iodine Cotton Swab	Winner Medical Co., Ltd.	608-000247
Needle holder	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.	J32030	14 cm fine needle
Sterile surgical blade	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD	#11
Suigical Blade Holder	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD	K6-10	Straight 3#
Suture thread with needle	Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd		needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm
Tying Forceps	Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd	MR-F201T-3	Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head