Mikrochirurgische Obstruktion der Hodenfusion bei Spodoptera litura

Zusammenfassung

Aluminiumfolie wurde mikrochirurgisch zwischen die Hoden von Spodoptera litura eingeführt, um die Verschmelzung der Hoden zu behindern. Das Verfahren umfasst Einfrieren, Befestigen, Desinfizieren, Einschneiden, Platzieren der Barriere, Nähen, postoperative Fütterung und Inspektion. Dieser Ansatz bietet eine Methode, um die Gewebebildung zu stören.

Zusammenfassung

Anstatt genetische Methoden wie RNA-Interferenz (RNAi) und regelmäßig interspaced kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) / CRISPR-assoziierte Endonuklease Cas9 zu verwenden, wurde eine physikalische Barriere mikrochirurgisch zwischen den Hoden von Spodoptera litura eingeführt, um die Auswirkungen dieser Mikrochirurgie auf ihr Wachstum und ihre Fortpflanzung zu untersuchen. Nach dem Einlegen von Aluminiumfolie zwischen den Hoden verlief die Häutung von Insekten während der Metamorphose normal. Das Wachstum und die Entwicklung von Insekten wurden nicht nennenswert verändert; Die Anzahl der Spermienbündel änderte sich jedoch, wenn die Hodenfusion durch die Mikrochirurgie gestoppt wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Blockierung der Hodenfusion die männliche Fortpflanzungsfähigkeit beeinflussen kann. Die Methode kann weiter angewendet werden, um die Kommunikation zwischen Organen zu unterbrechen, um die Funktion spezifischer Signalwege zu untersuchen. Im Vergleich zur konventionellen Chirurgie erfordert die Mikrochirurgie nur eine Gefrieranästhesie, die der Kohlendioxidanästhesie vorzuziehen ist. Die Mikrochirurgie minimiert auch den Bereich der Operationsstelle und erleichtert die Wundheilung. Die Auswahl von Materialien mit spezifischen Funktionen bedarf jedoch weiterer Untersuchungen. Die Vermeidung von Gewebeverletzungen ist bei Einschnitten während der Operation von entscheidender Bedeutung.

Einleitung

Fusion ist ein häufiges Phänomen in der Gewebe- oder Organentwicklung. Beispiele hierfür sind der dorsale Verschluss und der Thoraxverschluss bei Drosophila1 und der Gaumenmorphogenese, die Neuralrohrmorphogenese und die Herzmorphogenese bei Mäusen und Hühnern2. CRISPR und RNAi wurden angewendet, um die Rolle von Genen im ^{Fusionsprozess zu untersuchen2,3,4}.

Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) ist ein schädlicher polyphager Schädling, der in tropischen und subtropischen Gebieten Asiens, einschließlich China, weit verbreitet ^ist4,5,6. Die weite Verbreitung von S. litura wird zum Teil auf seine starke Fortpflanzungsfähigkeit zurückgeführt, die für die Entwicklung von Gonaden relevant ist. Männliche Unfruchtbarkeit ist ein Ansatz, um diesen Schädling zu kontrollieren. Wie in der schematischen Abbildung der Hodenstruktur gezeigt, sind die Hoden von der Hodenscheide umgeben, einschließlich der äußeren Scheide (Peritonealscheide) und der inneren Basallamina. Die Basallamina erstreckt sich intern zur Bildung des Follikelepits und trennt den inneren Bereich des Hodens in vier Kammern, die Follikel genannt werden (Abbildung 1).

In den Follikeln entwickeln sich Spermatogonien nach Mitose und Meiose zu Spermatozoen, und dann richten sich die Spermatozoen in den Spermiensäcken in der gleichen Richtung aus, um Spermienbündel zu ^bilden7. Während der Spermatogenese differenzieren sich die primären Spermatozyten in Eupyrenspermien oder Apyrenspermien. Spermatozyten in der Larvenphase entwickeln sich zu Eupyrenspermien mit einem langen Schwanz, der mit einem Kopf eines länglichen Kerns verbunden ist; Diese können Eier befruchten. Umgekehrt entwickeln sich Spermatozyten in der mittleren Puppenphase zu Apyrenspermien mit einem verworfenen Kern; Diese Spermien unterstützen das Überleben, die Bewegung und die Befruchtung von Eupyrenspermien9,10. Der 6. Tag der Puppe ist der Zeitraum, in dem die Hoden reichlich Eupyren- und Apyren-Spermienbündel haben^.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Hodenstruktur von Lepidoptera-Insekten11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Hodenfusion tritt bei den meisten Insekten der Lepidoptera-Ordnung ^auf11,12, insbesondere bei Arten, die landwirtschaftliche Schädlinge sind. Hodenfusion bezieht sich auf ein Hodenpaar, das in der Larvenphase bilateral wächst, sich einander nähert und anhaftet und sich schließlich in eine einzelne Gonade ^{integriert11.} Bei Spodoptera litura geschieht dies während der Metamorphose vom Larven- zum Puppenstadium. Von Tag 1 des 5. Instar (L5D1) bis Tag 4 des 6. Instar (L6D4) wächst das Hodenpaar allmählich an Größe, und die Farbe färbt sich hellgelb von elfenbeinweiß^. Es wird schwach rot, wenn es die präpupale Phase erreicht (L6D5 bis L6D6). Zwei bilaterale symmetrische Hoden nähern sich während des präpupalen Stadiums aneinander, verschmelzen zu einem und drehen sich gegen den Uhrzeigersinn (dorale Ansicht), um in der Puppen- und Erwachsenenphase einen einzigen Hoden zu ^erzeugen11. Dieses Phänomen tritt bei Seidenraupen nicht auf, die eine beträchtliche wirtschaftliche Bedeutung haben und seit 5000 Jahren domestiziert ^sind13. Daher wird angenommen, dass die Fusion der Hoden die Fortpflanzungsfähigkeit verbessert.

Um die Bedeutung der Hodenfusion von Spodoptera litura zu bestimmen, ist es wichtig, die Auswirkungen der Blockierung des Prozesses zu untersuchen. In diesem Protokoll wurde Aluminiumfolie mikrochirurgisch zwischen die Hoden gelegt, um sie getrennt zu halten, und die daraus resultierenden Veränderungen in der Entwicklung der Insekten und ihrer Hoden wurden untersucht.

Protokoll

1. Aufzucht und Pflege von Insekten

1. Kultivieren Sie die Spodoptera litura Larven in Umweltsimulationskammern mit einer künstlichen Diät, bis sie Tag 4 des 6. Instadiums (L6D4) erreichen^. Wählen Sie männliche Larven aus, wenn die Würmer in den ersten Tag des 6. Instadiums (L6D0) eintreten, basierend auf der inversen dreieckigen Struktur am achten ^Bauch14.
   HINWEIS: Larvenaufzucht- und -pflegetechniken wurden bereits ^{veröffentlicht4,14}.

2. Prächirurgische Vorbereitung

1. Schneiden Sie die Aluminiumfolie in rechteckige Stücke mit abgerundeten Ecken (1 mm x 2 mm, Abbildung 2).
2. Sterilisieren Sie die Operationsplattform und verwandte Gegenstände (Tischoberfläche, Mikroskop, Eisfach, Insektenkasten, Wachsschale, Stifte und Faden), indem Sie 75% Alkohol auf ihre Oberfläche sprühen und abwischen.
3. Sterilisieren Sie chirurgische Werkzeuge (einschließlich der Aluminiumfolie) mit einem Hochdruck-Dampfsterilisator für 30 min und stellen Sie sie in einen Heiz- und Trockenofen bei 120 ° C.
4. Stellen Sie sicher, dass die Bediener saubere Laborkleidung, chirurgische Masken und sterile Handschuhe tragen.

3. Mikrochirurgische Platzierung einer Barriere zwischen den Hoden

HINWEIS: Der allgemeine Arbeitsablauf ist wie folgt: Einfrieren → Fixieren → Desinfektion → Schneiden → Platzieren → Nähen von Barrieren→ Postoperative Fütterung und Inspektion

1. Legen Sie männliche Larven (L6D4) für 10-30 Minuten auf Eis, um sie während der Operation betäubt zu halten.
2. Legen Sie eine Larve mit der dorsalen Seite nach oben auf die Wachsschale und fixieren Sie dann den Kopf und den Schwanz der Larve mit Stiften und Fäden, wobei der Operationsbereich, der die dorsale Oberfläche des 9^. Körpersegments ist, gezeigt wird (Abbildung 3A).
3. Desinfizieren Sie den Operationsbereich, indem Sie 3% Jodtinktur mit einem Wattestäbchen auf die Epidermis (9^. Körpersegment) auftragen, gefolgt von 70% Alkohol, um das Jod zu entfernen (Abbildung 3B).
   HINWEIS: Konzentrieren Sie sich auf die Larve durch grobe und feine Einstellung des Operationsmikroskops (Abbildung 3C). Legen Sie die Wachsschale auf eine größere Kulturschale, die mit Eis gefüllt ist, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.
4. Machen Sie einen 2 mm langen Schnitt an der dorsalen Epidermis des 9^. Körpersegments. Als nächstes verwenden Sie ein steriles Wattestäbchen, um undichte Hämolymph- und Fettkörper zu entfernen und eine klare Sicht auf den Operationsbereich zu erhalten.
   HINWEIS: Es ist wichtig, das Herz während des Eingriffs zu vermeiden. Dies kann geschehen, indem der Schnitt leicht neben der Mittellinie im 9. Körpersegment oder am Gelenk zwischen dem 9. und ^10. Körpersegment gemacht wird, um zu verhindern, dass die Hoden aufgrund des Larveninnendrucks herausspringen^. Während Sie das Skalpell verwenden, machen Sie zuerst einen vertikalen Schlitz mit der Klinge (Abbildung 4A) und drehen Sie ihn dann um 45° in Richtung der Epidermis, bevor Sie gleichmäßig und kontinuierlich durch die Epidermis schneiden (Abbildung 4B).
5. Verwenden Sie eine chirurgische Pinzette, um ein Stück Aluminiumfolie zwischen die Hoden einzuführen (Abbildung 5).
6. Schließen Sie am Ende der Operation den Einschnitt, um eine Infektion zu vermeiden, und lassen Sie die Larven sich von der Operation erholen.
   1. Schließen Sie die Epidermis mit einer laufenden Naht (Abbildung 6).
   2. Verwenden Sie einen Nadelhalter und eine chirurgische Pinzette, um einen chirurgischen quadratischen Knoten zu binden, wobei zwei gegenüberliegende spiegelbildliche einfache Knoten erforderlich sind (Abbildung 6D, E).
   3. Verwenden Sie eine Schere, um die überschüssige Naht von den Schlaufenschwänzen zu schneiden und ein 2 mm langes Gewinde zurückzulassen.
7. Legen Sie die Larve nach dem Nähen vorsichtig in die Aufzuchtbox und pflegen Sie sie in einer sauberen Umweltsimulationskammer. Beobachten Sie die Larven weiter.
   HINWEIS: Die Wunde hört auf, Hämolymphe auszutreten, und die Larven erholen sich allmählich nach der Operation. Die Würmer schließen ihre Metamorphose weiter ab.

Abbildung 2: Physische Barriere, die mit Aluminiumfolie (1 mm x 2 mm) hergestellt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Vor dem Schnitt. (A) Fixierung der Larve. (B) Desinfektion der Epidermis des Operationsbereichs. (C) Durchführung von Operationen unter dem Mikroskop. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Einschnitt . (A) Schneiden Sie die Larven vertikal mit der Klinge auf. (B) Drehen Sie die Klinge vor dem Durchschneiden um 45° in Richtung Epidermis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Einsetzen der physischen Barriere (Aluminiumfolie) zwischen den Hoden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Nähen . (A) Führen Sie die Nadel ein. (B) Ziehen Sie die Nadel zurück. (C) Ziehen Sie die Nadel zurück und klemmen Sie sie ein. (D) Binden Sie den ersten einfachen Knoten. (E) Binden Sie den gegenüberliegenden spiegelbildlichen einfachen Knoten. (F) Schneiden Sie überschüssiges Nahtgewinde ab. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergebnisse

Die Auswirkungen der Mikrochirurgie auf das Wachstum und die Entwicklung von Spodoptera litura
Die Mikrochirurgie hinterließ eine 2 mm lange Wunde an der dorsalen Larvenepidermis, die schließlich aufhörte, Hämolymphe auszulaufen und heilte. Die Larven durchliefen präpupale und pupale Stadien und schlossen sich ein, was darauf hindeutet, dass die Mikrochirurgie keinen großen Einfluss auf Wachstum und Entwicklung hatte. Als sich die Larven zu Puppen häu...

Diskussion

Nach der mikrochirurgischen Behinderung der Hodenfusion in Spodoptera litura nahm die Anzahl der Spermienbündel ab, was die Hypothese stützte, dass diese Fusion für die Fortpflanzungsfähigkeit von Vorteil ist. Die chirurgische Manipulation wird seit dem frühen 20. Jahrhundert verwendet, um die physiologische Entwicklung von Insekten zu untersuchen^. Um festzustellen, ob der Hirnnerv durch Insektenmetamorphose reguliert wird, führten einige Forscher Verfahren wie Ligatur und Enthauptung an verschi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
75% Rubbing alcohol	Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd	Q/370285HNW 001-2019
Colored Push Pins	Deli Group Co.,LTD	0042
Corneal Scissors	Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd	MR-S221A	Curved and blunt tip
Glad Aluminum Foil	Clorox China(Guangzhou) Limited	831457	10 cm*2.5 cm*0.6
Medical Cotton Swabs (Sterile)	Winner Medical Co., Ltd.	601-022921-01
Medical Iodine Cotton Swab	Winner Medical Co., Ltd.	608-000247
Needle holder	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.	J32030	14 cm fine needle
Sterile surgical blade	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD	#11
Suigical Blade Holder	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD	K6-10	Straight 3#
Suture thread with needle	Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd		needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm
Tying Forceps	Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd	MR-F201T-3	Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head