Obstrução microcirúrgica de Testes Fusion em Spodoptera litura

Resumo

A folha de alumínio foi microsurgicamente inserida entre os testículos de Spodoptera litura para obstruir a fusão de testis. O procedimento inclui congelamento, fixação, desinfecção, incisão, colocação da barreira, sutura, alimentação pós-operatória e inspeção. Essa abordagem fornece um método para interferir na formação de tecidos.

Resumo

Em vez de usar métodos genéticos como a interferência de RNA (RNAi) e agrupar regularmente repetições palindrômicas curtas interespaçadas (CRISPR)/CRISPR-associated Cas9, uma barreira física foi microsurgicamente inserida entre os testículos de Spodoptera litura para estudar o impacto desta microcirurgia em seu crescimento e reprodução. Após inserir papel alumínio entre os testículos, a fusão de insetos durante a metamorfose prosseguiu normalmente. O crescimento e o desenvolvimento de insetos não foram notavelmente alterados; no entanto, o número de pacotes de esperma mudou se a fusão de testículos fosse interrompida pela microcirurgia. Esses achados implicam que o bloqueio da fusão testicular pode influenciar a capacidade de reprodução masculina. O método pode ser aplicado ainda mais para interromper a comunicação entre órgãos para estudar a função de vias de sinalização específicas. Em comparação com a cirurgia convencional, a microcirurgia requer apenas uma anestesia congelante, que é preferível à anestesia de dióxido de carbono. A microcirurgia também minimiza a área do local da cirurgia e facilita a cicatrização da ferida. No entanto, a seleção de materiais com funções específicas precisa ser aprofundada. Evitar lesões teciduais é crucial ao fazer incisões durante a operação.

Introdução

A fusão é um fenômeno comum no desenvolvimento de tecidos ou órgãos. Exemplos incluem fechamento dorsal e fechamento do tórax em Drosophila1 e morfogênese do paladar, morfogênese do tubo neural e morfogênese cardíaca em camundongos e ^frango2. CRISPR e RNAi têm sido aplicados para investigar os papéis dos genes no processo de fusão2,3,4.

Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) é uma praga polifagosa prejudicial que é amplamente distribuída em áreas tropicais e subtropicais da Ásia, incluindo ^China4,5,6. A ampla distribuição da S. litura é parcialmente atribuída à sua poderosa capacidade reprodutiva, que é relevante para o desenvolvimento da gônada. A infertilidade masculina é uma abordagem para controlar esta praga. Como mostrado na figura esquemática da estrutura testicular, os testículos são incluídos pela baia testicular, incluindo a baáta externa (baia peritoneal) e a lamina basal interna. A lamina basal se estende internamente para formar o epitélio folicular e separa a área interna dos testículos em quatro câmaras chamadas folículos (Figura 1).

Nos folículos, a espermatogonia se desenvolve em espermatozoides após mitose e meiose, e então os espermatozoides nos sacos de esperma se alinham na mesma direção para formar espermatozoides7. Durante a espermatogênese, os espermatotozóides primários se diferenciam em espermatozoides eupyrenos ou espermatozoides apirenos. Os espermatotozóides na fase larval desenvolvem-se em esperma de eupirrena com uma cauda longa conectada a uma cabeça de um núcleo alongado; estes podem fertilizar ovos. Por outro lado, os espermatocitotas na fase de pupal médio desenvolvem-se em espermatozoides apirene com um núcleo descartado; esses espermatozoides auxiliam na sobrevivência, movimento e fertilização do esperma eupyreno9,10. O ^{sexto dia da} pupa é o período durante o qual os testículos têm abundantes pacotes de esperma de eupirrena e apirena.

Figura 1: Diagrama esquemático da estrutura testicular dos insetos Lepidoptera11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A fusão testicular ocorre na maioria dos insetos da ordem Lepidoptera11,12, especialmente nas espécies que são pragas agrícolas. A fusão testicular refere-se a um par de testículos crescendo bilateralmente na fase larval, aproximando-se e aderindo uns aos outros, eventualmente integrando-se em uma única ^gônada11. Em Spodoptera litura, acontece durante a metamorfose da larval ao estágio pupal. Do primeiro dia do ^5º instar (L5D1) ao ^{4º dia da 6ª} instar (L6D4), o par de testículos cresce gradualmente em tamanho, e a cor fica amarelo claro do branco-marfim. Torna-se vermelho fraco à medida que atinge a fase prepupal (L6D5 a L6D6). Dois testículos simétricos bilaterais se aproximam durante o estágio prepupal, fundem-se em um, e torcem no sentido anti-horário (visão doral) para produzir um único testículo nas fases pupal e ^adulta11. Esse fenômeno não ocorre em bichos-da-seda, que têm considerável importância econômica e foram domesticados por 5000 ^anos13. Assim, supõe-se que a fusão dos testículos melhora a capacidade reprodutiva.

Para determinar a significância da fusão testicular Spodoptera litura , é importante investigar os efeitos do bloqueio do processo. Neste protocolo, a folha de alumínio foi microsurgicamente inserida entre os testículos para mantê-los separados, e foram estudadas as consequentes mudanças no desenvolvimento dos insetos e seus testículos.

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Protocolo

1. Criação e manutenção de insetos

1. Cultura as larvas Spodoptera litura em câmaras de simulação ambiental com uma dieta artificial até chegarem ao 4º dia da ^6ª instar (L6D4). Selecione larvas masculinas quando os vermes entrarem no primeiro dia do ^6º instar (L6D0) com base na estrutura em forma de triângulo inverso no oitavo ^abdômen14.
   NOTA: As técnicas de criação e manutenção de larvas foram publicadas ^{anteriormente4,14}.

2. Preparação pré-úrgica

1. Corte a folha de alumínio em pedaços retangulares com cantos arredondados (1 mm x 2 mm, Figura 2).
2. Esterilize a plataforma de cirurgia e itens relacionados (superfície de mesa, microscópio, geladeira, caixa de insetos, bandeja de cera, pinos e rosca) pulverizando 75% de álcool em sua superfície e limpando-os.
3. Esterilize ferramentas cirúrgicas (incluindo a folha de alumínio) com um esterilizador a vapor de alta pressão por 30 minutos, e coloque-as em um forno de aquecimento e secagem a 120 °C.
4. Certifique-se de que os operadores usem roupas de laboratório limpas, máscaras cirúrgicas e luvas estéreis.

3. Colocação microcirúrgica de uma barreira entre os testículos

NOTA: O fluxo geral de trabalho é o seguinte: Congelamento → Fixação → Desinfecção → Incisão → Colocação da Barreira → Suturing→ Alimentação e Inspeção Pós-Operatória

1. Coloque larvas masculinas (L6D4) no gelo por 10-30 minutos para mantê-las anestesiadas durante a operação.
2. Coloque uma larva na bandeja de cera com o lado dorsal para cima e, em seguida, fixe a cabeça e a cauda da larva com pinos e fios, mostrando a área cirúrgica que é a superfície dorsal no segmento ^9º corpo (Figura 3A).
3. Desinfete a área cirúrgica aplicando 3% de tintura de iodo com cotonete na epiderme (^9º segmento corporal), seguido de 70% de álcool para remover o iodo (Figura 3B).
   NOTA: Concentre-se na larva através de ajuste grosseiro e fino do microscópio cirúrgico (Figura 3C). Coloque a bandeja de cera em um prato de cultura maior cheio de gelo para manter a anestesia.
4. Faça uma incisão de 2 mm de comprimento na epiderme dorsal do ^9º segmento corporal. Em seguida, use um cotonete estéril para remover qualquer hemoglifo e corpos de gordura que vazem e obtenha uma visão clara da área cirúrgica.
   NOTA: É importante evitar o coração durante o procedimento. Isso pode ser feito fazendo com que a incisão seja ligeiramente próxima à linha média do segmento do ^9º corpo ou na articulação entre os segmentos do ^9º e ^10º corpo para evitar que os testículos apaguem devido à pressão interna larval. Ao usar o bisturi, faça uma fenda vertical com a lâmina primeiro (Figura 4A), e depois gire-a 45° em direção à epiderme antes de cortar uniforme e continuamente através da epiderme (Figura 4B).
5. Use pinças cirúrgicas para inserir um pedaço de papel alumínio entre os testículos (Figura 5).
6. No final da cirurgia, feche a incisão para evitar infecções, e permita que as larvas se recuperem da cirurgia.
   1. Feche a epiderme com uma sutura em execução (Figura 6).
   2. Use um suporte de agulha e pinças cirúrgicas para amarrar um nó quadrado cirúrgico, exigindo dois nós simples de imagem espelhada (Figura 6D,E).
   3. Use uma tesoura para cortar o excesso de sutura das caudas do laço, deixando um fio de 2 mm para trás.
7. Após a sutura, coloque delicadamente a larva na caixa de criação e mantenha-as em uma câmara de simulação ambiental limpa. Continue observando as larvas.
   NOTA: A ferida pára de vazar hemoglifo, e as larvas se recuperam gradualmente após a cirurgia. Os vermes continuam a completar sua metamorfose.

Figura 2: Barreira física preparada usando papel alumínio (1 mm x 2 mm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Antes da incisão. (A) Fixação da larva. b Desinfecção da epiderme da área cirúrgica. (C) Fazendo cirurgia sob o microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Incisão. (A) Corte as larvas verticalmente com a lâmina. (B) Gire a lâmina 45° em direção à epiderme antes de cortar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Inserção da barreira física (folha de alumínio) entre os testículos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Sutura. (A) Insira a agulha. (B) Retire a agulha. (C) Retire e aperte a agulha. (D) Amarre o primeiro nó simples. (E) Amarre o nó simples com imagens espelhadas opostas. (F) Corte o excesso de sutura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

Os efeitos da microcirurgia no crescimento e desenvolvimento da Spodoptera litura
A microcirurgia deixou uma ferida de 2 mm de comprimento na epiderme larval dorsal que eventualmente parou de vazar hemoglifo e se curou. As larvas passaram por estágios prepupal e pupal e foram fechadas, indicando que a microcirurgia não teve grande impacto no crescimento e desenvolvimento. Quando as larvas se fundiram em pupas, os fios de sutura foram descartados junto com ...

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Discussão

Depois de obstruir microsurgicamente a fusão de testículos em Spodoptera litura, o número de espermatozoides diminuiu, o que apoiou a hipótese de que essa fusão é benéfica para a capacidade reprodutiva. A manipulação cirúrgica tem sido usada para estudar o desenvolvimento fisiológico de insetos desde o início ^{do século XX}. Para determinar se o nervo craniano é regulado pela metamorfose de insetos, alguns pesquisadores realizaram procedimentos como ligadura e decapitação em diferentes i...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
75% Rubbing alcohol	Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd	Q/370285HNW 001-2019
Colored Push Pins	Deli Group Co.,LTD	0042
Corneal Scissors	Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd	MR-S221A	Curved and blunt tip
Glad Aluminum Foil	Clorox China(Guangzhou) Limited	831457	10 cm*2.5 cm*0.6
Medical Cotton Swabs (Sterile)	Winner Medical Co., Ltd.	601-022921-01
Medical Iodine Cotton Swab	Winner Medical Co., Ltd.	608-000247
Needle holder	Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp.	J32030	14 cm fine needle
Sterile surgical blade	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD	#11
Suigical Blade Holder	Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD	K6-10	Straight 3#
Suture thread with needle	Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd		needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm
Tying Forceps	Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd	MR-F201T-3	Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head