监测斑马鱼幼虫的靶向信号反应 - Z-REX 揭示亲电药物和代谢物的精确机制

摘要

斑马鱼靶向反应性亲电试剂和氧化剂（Z-REX）是一种基于化学生物学的方法，用于研究反应性小分子信号传导。该技术可应用于不同发育阶段的活鱼。在这里，我们将斑马鱼的标准测定与Z-REX相结合以进行信号通路分析。

摘要

反应性代谢物和相关亲电药物是最具挑战性的小分子研究之一。解构此类分子的作用模式（MOA）的传统方法利用了对具有过量特定反应性物质的实验标本的批量处理。在这种方法中，亲电试剂的高反应性使得蛋白质组的无区别标记以时间和上下文依赖性的方式;氧化还原敏感的蛋白质和过程也可能间接且经常不可逆转地受到影响。在这种潜在靶标数不胜数和间接次级效应的背景下，将表型与特定靶标接合联系起来仍然是一项复杂的任务。斑马鱼靶向反应性亲电试剂和氧化剂（Z-REX）是一种适用于斑马鱼幼虫的按需反应亲电递送平台，旨在将亲电试剂递送到其他未受干扰的活鱼胚胎中的特定目标蛋白质（POI）。该技术的主要特征包括低水平的侵入性，以及剂量、化学型和时空控制的精确亲电试剂递送。因此，结合一套独特的对照，该技术避免了脱靶效应和全身毒性，否则在动物不受控制的大量暴露于反应性亲电试剂和多效性亲电药物后观察到。利用Z-REX技术，研究人员可以在了解个体应激反应和信号输出如何因特定POI的特定反应性配体参与而在完整活体动物的近生理条件下而改变。

引言

无数的细胞信号传导事件涉及小反应分子（在细胞中内源性产生或异生素/异种生物，如药物）与其蛋白质靶标之间的反应。在许多情况下，这种共价结合事件的亚化学计量水平可以触发细胞反应，导致例如发育、代谢、细胞凋亡和/或^{免疫反应的变化}1。然而，通过将特定的结合事件与其表型结果联系起来来解构作用模式（MOA）已被证明具有挑战性。涉及引入高浓度反应性物质的传统推注给药方法通常会导致多种蛋白质被修饰，以及对模式生物的过度^毒性2。这样的条件远非理想。开发了一种在天然细胞环境中使用精确定位亲电试剂递送来解决细胞培养中这些问题的方法，称为T-REX（可靶向反应性亲电试剂和氧化剂）³。在过去的几年里，重点转向了整个生物体的实验，这使得有机会在未转化细胞的特定细胞环境中研究蛋白质。因此，我们扩展了该技术以与多种模型兼容，包括 Danio rerio 胚胎模型。在本文中，我们提出了Z-REX（靶向反应性亲电试剂和氧化剂的斑马鱼）（图1）。

为了理解 Z-REX，本文首先介绍 REX 技术及其基本概念。这些技术的核心是通过模拟天然亲电试剂在 体内 以时空精度局部产生的方式来模拟内源性生理反应性亲电物种（RES）信号传导。目标蛋白（POI）表示为Halo的融合构建体;后者将带有光笼RES的组织渗透性和惰性探针锚定在1:1化学计量中。一种这样的内源性RES是4-羟基壬烯醛（以下简称HNE），它在探针Ht-PreHNE中被光笼化。在许多情况下，我们使用炔烃功能化的HNE版本[即HNE（炔烃）]，其生物学特性与HNE基本相同，但可以通过点击化学进行标记。该探针也用氯烷烃官能化以与Halo反应，称为Ht-PreHNE（炔烃）。Halo-POI融合和由此形成的探针的复合物允许在紫外线照射下将RES近端输送到融合的POI。如果POI与释放的RES反应迅速，则POI与RES的共价标记使我们能够识别运动特权半胱氨酸。

Z-REX利用REX技术的上述优势，并广泛应用于研究活鱼的特定信号通路。该协议已针对斑马鱼（D. rerio）进行了优化，因为它们是遗传上可处理的脊椎动物生物，在发育过程中是透明的，因此非常适合光化学/遗传技术，如REX技术。然而，类似的策略也可能在其他遗传可处理的鱼类物种上很好地工作，因为该方法的广泛适用性是由于脂质衍生亲电试剂（LDE）递送的伪分子内机制。事实上，该程序具有高度的生物相容性，因为可以用Z-REX光笼亲电试剂[例如，Ht-PreHNE（炔烃）]处理鱼至少48小时，而不会对发育产生任何明显影响。类似的协议在秀丽隐杆线虫 ^4,5 中起作用。

该协议首先描述了使用mRNA注射在胚胎斑马鱼模型中产生非天然Halo-POI融合构建体的瞬时表达，受精后1-1.5天（dpf）。这导致异位蛋白在鱼内的大多数细胞（以下简称"无处不在"）中表达，而不是在特定组织或地点中表达;然而，数据显示在某些情况下可以观察到细胞特异性效应。注射后，将胚胎与低浓度[0.3-5μM Ht-PreHNE（炔烃）]的探针孵育长达30.5小时（hpf）。然后，在用户规定的时间，通过光解笼2-5分钟将RES传递到鱼内的POI。在RES光解笼后，可以在接下来的2-10小时内进行各种下游表型测定:1）报告系的实时成像（图2A）;2）通过蛋白质印迹分析进行靶标标记评估（图3）;3）转录组分析（图4）;或4）全安装免疫荧光（图5）。

作为报告系实时成像的一个例子，Z-REX与鱼系Tg（lyz:TagRFP）和Tg（mpeg1:eGFP）的实时成像一起展示，以测量特定亲电传感器POI（即Keap1）的RES修饰如何分别降低中性粒细胞和巨噬细胞水平，而对鱼中的其他细胞没有可观察到的影响。然而，我们之前已经表明，来自T-REX研究的POI标记和相应的途径信号传导可以使用Z-REX对几种蛋白质进行复制:Akt3 6，Keap1⁷和Ube2v2⁶。总体而言，借助Z-REX，科学家可以在几种复杂的氧化还原途径的背景下研究RES对POI进行共价修饰的后果。该技术已准备好在更相关的全动物模型中精确定位靶标及其功能残基，以进行共价药物设计和新型药物机制。

研究方案

康奈尔大学（美国）的斑马鱼饲养和处理程序按照美国国立卫生研究院 （NIH） 的指导方针进行，并得到机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。瑞士洛桑联邦理工学院（瑞士洛桑联邦理工学院）斑马鱼部门的斑马鱼饲养和处理程序是根据《动物福利法》SR 455和动物福利条例SR 455.1进行的，并获得了州兽医授权VD-H23。

注意:在该协议中， Tg（lyz:TagRFP ）和 Tg（mpeg1:EGFP） 鱼系表达Halo-TeV-Keap1用于证明Z-REX。该方法可以扩展到其他感兴趣的蛋白质、转基因报告鱼系和下游生物测定。有关本研究中使用的缓冲液，请参阅 补充表1 。所有试剂、仪器、设备、抗体、质粒、斑马鱼菌株和设备均列在 材料表中。

1. 信使核糖核酸制备

1. 使用 mMessage mMachine SP6 体外 转录试剂盒制备 Halo-TeV-Keap1-2xHA 和 Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA mRNA。
   注意:按照制造商的说明对每个mRNA进行40μL规模的反应。将 mRNA 沉淀重新溶解在 10 μL 无核酸酶水中。
2. 评估mRNA质量并通过微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳测量浓度。高质量的 mRNA 应具有大约_{2.0 或高于 2.0 的 A 260}/A₂₈₀ 比率。
3. 用无核酸酶的水将 mRNA 稀释至 1-1.5 mg/mL。
4. 等分mRNA溶液（每管1-2μL），并将等分试样储存在-80°C。

2. 生产鱼胚

1. 选项1:生产野生型（WT）鱼胚胎。
   1. 在10个单独的水箱中设置10对鱼，每个水箱在雄鱼和雌性亲鱼之间包含一个分隔器。
      注意:总共10个交叉对通常为测定提供足够数量的胚胎。杂交对的数量可以根据实验设计/需要和亲鱼的繁殖力进行调整。
   2. 第二天早上，设置喷油器后，拆下五个水箱中的分隔器。等待30分钟让鱼交配。
   3. 将亲鱼移动到另一个水箱中，通过将水箱水通过过滤器来收集胚胎，然后将过滤器中的胚胎冲洗到10厘米的培养皿中。这些胚胎将用于第一轮注射。
      注意:如果某个批次的卵子质量差（例如，由于蛋白质聚集，鸡蛋不透明），不要将它们与其他胚胎合并。
   4. （可选）在其他五个储罐上执行步骤2.1.2-2.1.3中所述的类似程序以进行下一轮注射。
      注意:最好只进行一轮注射，以尽量减少胚胎之间的年龄差异。但是，如果需要的胚胎多于一个批次可以注射的胚胎，建议进行两轮注射，以确保胚胎在mRNA注射期间保持在1-4细胞阶段。注射轮数可根据操作人员的注射技能和实验设计进行调整。但是，建议在2小时内执行整个过程（从去除第一个分隔器到注射最后一个胚胎）。胚胎之间的年龄差异很大可能会损害实验结果的可靠性和可重复性。
2. 选项2:产生杂合子转基因中性粒细胞/巨噬细胞报告鱼胚胎。
   1. 在10个单独的水箱中设置10个鱼交叉对，每个水箱在雄性和雌性亲鱼之间插入一个分隔器:WT鱼与Tg（lyz:TagRFP）或WT鱼与Tg（mpeg1:eGFP）。
      注意:避免杂合转基因鱼之间的杂交，这可能会影响下游荧光读数，因为与杂合鱼相比，纯合子报告鱼显示出更高的荧光信号。转基因报告系和WT胚胎在成像时很容易区分。在同一池中混合WT和杂合胚胎不是问题。 lyz:TagRFP 报告中性粒细胞， mpeg:eGFP 报告巨噬细胞。该协议也可以应用于其他报告鱼系。
   2. 按照步骤 2.1.2-2.1.4 操作。

3. 微量注射器设置

1. 打开气源，将背压设置为 0.2-0.5 psi，并将注射压力设置为 25-30 psi。通常建议使用所示的特定压力范围。
   注意:必须有稳定的背压，以防止鱼介质回流到针中。在步骤3.8中校准进样体积时，仅应更改进样时间。不要在以下步骤中改变注射压力;由于表面和界面张力，低注射压力会导致注射失败，而高注射压力会损坏胚胎。
2. 用RNase去污溶液清洁设备和注射平台。
   注意:降解mRNA的RNase可能来自操作员或设备。有必要在实验前进行清理，并戴上手套。
3. （可选）如果共注射 mRNA 和吗啉素，请将两者在 0.2 mL 管中预混合。
   注意:Z-REX通过使用浓度为250-1500ng / μL的Halo-TeV-Keap1-2xHA mRNA溶液效果很好。斑马鱼中也使用了几种吗啉诺，据报道最佳浓度为⁷。如果使用具有未发表序列的吗啉诺，操作人员应首先评估吗啉诺的毒性和基因敲低效率，然后再将其用于Z-REX中。
4. 将 1-2 μL mRNA（和/或吗啉诺，如适用⁷）转移到带有微量装载器移液器吸头的进样针中。
   注意:如果使用火焰/棕色微量移液器拉拔器制备针头，则设置如下。热量:520个单位;拉力:60单位;速度:70个单位;延迟:155个单位;压力:550单位;坡道:530个单位。
5. 将针头安装在显微注射机械手上。
   注意:来自空气源的背压应将mRNA（/吗啉）溶液推到针尖。
6. 使用锋利的镊子或剃须刀片折断针尖，形成适合注射的开口。
7. 将针尖浸入载物台千分尺上的矿物油中。
8. 施加两次或三次注射脉冲以去除尖端中的气泡。
9. 通过改变注射时间将液滴大小校准为 2 nL。
   注意:最好通过将沉积在血细胞计数器上的矿物油（模拟卵黄囊的粘度）来执行此操作。使用显微镜，使用血细胞计数器的网格线估计注射过程中形成的液滴的大小，并相应地调整注射时间。尽管有时使用酚红染料，但尚未观察到此处描述的mRNA注射过程中对它的需求。

4. 显微注射

1. 用新鲜的10%汉克平衡盐溶液（HBSS）培养基填充注射板，并用钝钳将胚胎对准板的凹槽中。
   注意:注射板在10%HBSS培养基中用2%琼脂糖制备;凹槽是用塑料模具形成的。
2. 将针尖浸入注射板中的10%HBSS培养基中。
3. 施加两次或三次注射脉冲以去除尖端中的气泡。
4. 对于每次注射，一次移动穿透绒毛膜和卵黄囊并施加注射脉冲。注射后，这种注入的液体可以立即看到蛋黄囊内的小球体。这个小球体消散相对较快。对其他胚胎重复此步骤，直到获得足够数量的注射胚胎。
   注意:胚胎（注射和非注射）的存活率通常在50%-90%之间变化。目标是注射每个对照/实验组所需胚胎数量的两倍。在生物素下拉测定中，每种情况需要100-140个活胚胎。在qRT-PCR测定中，每种情况推荐五个活胚胎。活鱼成像和全安装免疫荧光染色测定的样本量是用户定义的;建议每种情况下至少有20个活胚胎，以便在分析中产生良好的统计功效。
5. 将注射的胚胎冲洗到含有新鲜10%HBSS培养基的新10厘米培养皿中。
   注意:胚胎可以使用喷瓶轻松地从凹槽中冲洗出来。
6. 将未注射的胚胎汇集到另一个板中。
   注意:根据需要，未注射的胚胎可以作为鱼的健康，基线蛋白质表达，背景荧光水平等的质量控制。如果注射程序效果良好，并且注射的mRNA /吗啉诺对胚胎不致命，则注射和非注射胚胎应具有相似的活力。

5. Z-霸王龙

1. 根据实验设置（即对照/实验组的数量），将注射的胚胎分配到10厘米的培养皿中。
2. 在具有红光照明的暗室中，用 30 mL 的 10% HBSS 替换培养基，含或不含 1 μM Ht-PreHNE（炔烃）。
   注意:Ht-PreHNE（炔烃）是一种光不稳定的化合物。在以下步骤中，胚胎应被蒙在鼓里。
3. 在黑暗中将胚胎在28.5°C孵育。
4. 在 30.5 hpf 的暗室中，用新鲜的 30 mL 10% HBSS 替换培养基。
   注:更换介质时，请尽可能多地取出旧介质。这对于从胚胎中去除未结合/过量的Ht-PreHNE（炔烃）至关重要。
5. 将胚胎在28.5°C的黑暗中孵育30分钟。
6. 再重复步骤 5.4-5.5 两次。
7. 打开紫外灯（365nm，3mW/cm²）5分钟以预热灯。
   注意:灯预热步骤必须在步骤5.8之前执行。灯功率在打开后的最初几分钟内较低/不稳定。灯的功率应定期用紫外线计测量。
8. 在 32 hpf 下，将胚胎暴露在紫外线下。
   1. 选项 1:对于下游读数，例如活鱼成像、全卡口免疫荧光染色、凝胶内荧光分析（与 Cy5 叠氮化物点击偶联）、RNA-seq 或 qRT-PCR，将胚胎暴露在紫外线下 3 分钟，每 30 秒旋转一次板。
   2. 选项2:对于下游读数，例如生物素下拉测定，将胚胎暴露在紫外线下最多5分钟（最少3分钟），每30秒旋转一次板，并将板在冰上冷却1分钟。
      注意:如果使用不同的探头，则需要优化曝光时间，具体取决于给定的光笼式亲电试剂探头和部署的光源的光解笼的_{t 1/2}。t_1/2光^解笼可以使用已知程序⁸确定。对于Ht-PreHNE（炔烃），t_1/2<1分钟³;因此，上述指示的时间就足够了。

6. 下游检测

1. 选项1:表型测定。转基因中性粒细胞/巨噬细胞报告基因的实时成像
   鱼线，Tg（lyz:TagRFP）和Tg（mpeg1:eGFP）（图2）
   1. 通过在4°C孵育10分钟来麻醉胚胎。
      注意:建议每种情况下至少有20个活胚胎。
   2. 从平板上取出未受精/死亡的胚胎。
      注意:未受精/死亡的胚胎是混浊的/不透明的，可以目视识别。如果发现高死亡率，请检查注射程序或尝试降低mRNA或吗啉诺的浓度。
   3. 用锋利的镊子去皮胚。用一对镊子握住绒毛膜，不要接触幼鱼，用另一对镊子撕掉绒毛膜。胚胎是脆弱的。仅在进行去皮屑时触摸绒毛膜。
      注意:在去皮质过程中损坏一些胚胎是很常见的，尤其是在初学者中。因此，总是有更多的胚胎超过所需的最小数量。
   4. 将胚胎安装在2%琼脂糖平板（用10%HBSS培养基制备）上，并用体视显微镜（明场和相应的荧光通道）对胚胎进行成像（图2A，C，G）。
      注意:在Z-REX [卤素-TeV-Keap1-2xHA mRNA注射和Ht-PreHNE（炔烃）处理的组合]后，发现中性粒细胞（lyz:TagRFP）的消耗在36 hpf（Z-REX后4小时）最显着，而巨噬细胞（mpeg1:eGFP）的减少在34 hpf（Z-REX后2小时）最显着（图2E，F）。如果使用不同的报告基因系、mRNA/吗啉或探针，则可以使用其他时间点。曝光时间和/或增益必须优化，以可视化单个细胞或所需的特定（超）结构。
   5. 通过ImageJ（NIH）计数每条鱼的中性粒细胞/巨噬细胞数量（图2B，D-F，H）。使用 ImageJ 中的手绘选择工具圈出整条鱼，并使用选项"查找千里马"对荧光细胞进行计数。
2. 备选办法2:目标标签评估。生物素叠氮化物点击偶联和生物素下拉测定（图3)
   1. 通过在4°C下孵育麻醉胚胎。 这通常需要 10 分钟。
      注意:为了获得足够的鱼裂解物，每种情况都需要100-140个活胚胎。
   2. 从平板上取出未受精/死亡的胚胎。
   3. 进行去皮和去阳糖。通过用一对锋利的镊子握住绒毛膜，用另一对镊子穿透卵黄囊，然后在取出绒毛膜的同时分离蛋黄囊以使蛋黄蛋白出来来进行这两种操作。
      注意:在此步骤中去除蛋黄蛋白至关重要。样品中丰富的卵黄蛋白会干扰以后的分析。
   4. 将脱脂胚胎转移到 1.5 mL 管中。
      注意:旋转板以将脱脂胚胎居中，这有助于收集。在此过程中，较轻的绒毛膜碎屑会消失。
   5. 胚胎稳定到管底后，除去上清液，并加入 1 mL 冷却的 HEPES 缓冲盐水 （pH 7.6）。
   6. 再重复步骤 6.2.5 两次。
   7. （可选）如果不打算立即进行下一步，请取出缓冲液，将样品快速冷冻在液氮中，并将其储存在-80°C。
      注意:脱黄鱼丸可以在液氮中快速冷冻并储存在-80°C。 速冻样品可在-80°C下储存长达2周。
   8. 将鱼丸重悬于裂解缓冲液中。
      注意:裂解缓冲液（pH 7.6）由50 mM HEPES，100 mM NaCl，1%Triton X-100,0.3 mM TCEP，2x 罗氏完全迷你无EDTA蛋白酶抑制剂和来自大豆的0.1 mg / mL胰蛋白酶抑制剂组成。一个胚胎产生约2μg裂解物。每 120 个胚胎使用 100 μL 裂解缓冲液。使用前应将两种罗氏 cOmplete Mini 不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂和来自大豆的胰蛋白酶抑制剂添加到裂解缓冲液中。
   9. 在管中加入 20% v/v 氧化锆珠。
   10. 涡旋20秒，在液氮中快速冷冻，并在37°C水浴中解冻。
   11. 再重复步骤 6.2.10 两次。
   12. 将溶液在4°C下以21,000× g 离心10分钟。
   13. 将上清液转移到新的预冷 1.5 mL 管中。
   14. 通过布拉德福德测定法测量蛋白质浓度。
   15. 将裂解物稀释至 1 mg/mL。
   16. 对于每种情况，将 170 μg 裂解物转移到 2 mL 管中。
   17. 将步骤6.2.16中的裂解物与0.2mg / mL TeV蛋白酶（S219V）混合，并将溶液在37°C孵育30分钟。
       注意:对于非TeV蛋白酶处理的组，只需将裂解物与其他组中使用的TeV蛋白酶溶液等体积的裂解缓冲液混合即可。
   18. 为生物素-叠氮化物点击反应准备 10x 预混液:10% w/v SDS、10 mM CuSO₄、1 mM Cu（TBTA）、1 mM 生物素叠氮化物和 20 mM TCEP。
       注意:在步骤 6.2.19 之前将 TCEP 添加到混合物中。
   19. 将 8.5 μL t-BuOH 和 17 μL 10x 点击反应预混液添加到步骤 6.2.17 中的（TeV 蛋白酶消化）裂解物中。涡旋，离心，并将溶液在37°C孵育15分钟。
   20. 向溶液中加入另外1mM TCEP，然后涡旋，离心，并将溶液在37°C下再孵育15分钟。步骤6.2.19-6.2.20的孵育时间总共为30分钟。
       注意:TCEP的这种补充，一种用于生成Cu（I）的还原试剂，可提高点击反应效率。
   21. 向每个试管中加入 600 μL -20 °C 乙醇，涡旋溶液，并在 -80 °C 下孵育过夜。
       注意:样品可以在-80°C下储存1周;如果没有，请立即继续执行下一步。
   22. 将溶液在4°C下以21,000× g 离心1小时。
       注意:离心后应在管底部形成沉淀，这是所需的部分。
   23. 除去上清液，加入1mL的-20°C乙醇，涡旋，并将溶液在4°C下以21,000× g 离心10分钟。
   24. 重复步骤 6.2.23。
   25. 除去上清液，加入1mL的-20°C丙酮，涡旋，并将溶液在4°C下以21,000× g 离心10分钟。
   26. 除去上清液。让多余的残留丙酮蒸发，但不能完全变干。
   27. 将沉淀重悬于 100 μL 重悬缓冲液（8% w/v 十二烷基硫酸锂 [LDS]，1 mM EDTA 在 50 mM HEPES 盐水中，pH 7.6）中，涡旋 15 秒，超声处理直至沉淀溶解。
   28. 在室温（RT）下以21,000× g 离心溶液5分钟。
   29. 将上清液转移到新的 2 mL 管中，并加入 1.5 mL 的 50 mM HEPES 盐水，pH 7.6。
       注意:此步骤中LDS的最终浓度为0.5%。较高的LDS浓度可能会破坏下拉效率。因此，尽管增加LDS浓度可以帮助减少非特异性结合，但它也可能降低下拉的效率。因此，建议不要在此步骤中改变LDS浓度。
   30. 收集"输入"样品（图 3）:将 30 μL 1 mg/mL 裂解物转移到新的 1.5 mL 管中，并加入 10 μL 含有 6% β-巯基乙醇 （BME） 的 4x Laemmli 样品缓冲液。快速冷冻溶液，并将其储存在-80°C。
   31. 将 100 μL 床体积链霉亲和素高容量树脂转移到新的 2 mL 管中。在50mM HEPES盐水（pH 7.6）中加入1mL的0.5%LDS，在室温下以1,500× g 离心2分钟，并除去上清液。用另外 1 mL 的 0.5% LDS 在 50 mM HEPES 盐水 （pH 7.6） 中重复洗涤。
   32. 将步骤6.2.29中的溶液转移到含有步骤6.2.31预洗的链霉亲和素高容量树脂的管中，并将溶液在室温下在端对端混合器上孵育4-6小时。
   33. 将混合物在室温下以 1,500 x g 离心 2 分钟，取 30 μL 上清液，并将其与 10 μL 含有 6% BME 的 4x Laemmli 样品缓冲液混合，用于"流通"样品。然后，除去剩余的上清液。
       注意:"流通"样品可以通过蛋白质印迹分析，以检查链霉亲和素下拉效率。必须尽可能多地去除上清液以洗掉未结合的蛋白质。首先，使用 P-1000 移液器去除大部分上清液，然后使用带有凝胶上样吸头的 P-20 移液器去除剩余的上清液。
   34. 向树脂中加入 1 mL 的 0.5% LDS 在 50 mM HEPES 盐水 （pH 7.6） 中，并将混合物在室温下孵育 30 分钟，并端到端旋转。
   35. 将混合物在室温下以1,500× g 离心2分钟，并除去上清液。
       注意:通常，0.5%LDS足以去除大多数非特异性结合蛋白。如果在以后的分析中仍然看到非特异性结合信号，则可以增加洗涤缓冲液中的LDS浓度。
   36. 再重复步骤 6.2.34-6.2.35 两次。
   37. 向树脂中加入 40 μL 含有 6% BME 的 2x Laemmli 样品缓冲液。
   38. 通过将混合物在98°C孵育5分钟来洗脱结合的蛋白质。
   39. 将混合物在室温下以 21,000 x g 离心 5 分钟，并将上清液转移到新的 1.5 mL 管中。这是"洗脱"样品。
       注意:将含有步骤6.2.38中树脂的溶液直接加载到凝胶中可能会影响SDS-PAGE分析。
   40. 将 20 μL 加载到 10 泳道 10% 聚丙烯酰胺凝胶的每个孔中，并进行凝胶电泳。
       注意:以较低的电压（120 V）运行凝胶，直到染料前沿到达分离凝胶，并将电压更改为170 V.染料前沿出来后停止程序。
   41. 使用抗HA、抗晕或其他抗体进行蛋白质印迹，检测管家蛋白（图3）。
3. 选项3:转录组学分析。RNA-seq 和 qRT-PCR（图 4）
   注意:强烈建议使用彼此相距15分钟内放置的胚胎进行此测定。胚胎的年龄差异显着影响测定结果。
   1. 通过在Z-REX后在4°C孵育10分钟，2小时来麻醉胚胎。
   2. 用锋利的镊子进行去皮（步骤6.1.3）。
   3. （可选）如果要单独分析不同的节段，则用镊子进行分割（例如，将头部与尾部分开）。
   4. 如果从整个胚胎中提取RNA，则将三到五个胚胎转移到1.5 mL管中。如果从头部或尾部提取RNA，则将10-12个解剖片段转移到1.5 mL管中。
      注意:建议进行三到五个生物学重复的实验。
   5. 向管中加入 1 mL TRIzol 试剂和玻璃珠。
      注意:发现玻璃珠比氧化锆珠在RNA提取方面效果更好。
   6. 涡旋混合物30秒。
      注意:如果不立即进行下一步，溶液可以在-80°C下储存1-3周。
   7. 根据制造商的说明提取RNA。
   8. 通过微量分光光度计和琼脂糖凝胶电泳评估RNA质量和浓度。
      注意:质量好的RNA应具有A₂₆₀ / A₂₈₀ 的比例约为或高于2.0。
   9. 要么提交RNA进行测序，要么用扩增级DNase I处理1μgRNA，并使用上标III逆转录酶和寡核苷酸-（dT）₂₀进行逆转录。根据制造商的说明执行此步骤。
   10. 执行qRT-PCR并通过ΔΔCT方法⁹分析数据（图4B-D）。
4. 选项4:POI表达和共定位分析。全卡口免疫荧光染色测定（图5）
   注意:甲醛固定胚胎是脆弱的。避免剧烈摇晃，并小心处理。
   1. 按照步骤6.1.1-6.1.3对胚胎进行去皮。
   2. 将胚胎转移到 1.5 mL 管中。
      注意:每个试管应具有相同数量的胚胎，并且不超过40个胚胎。
   3. 胚胎沉降到管底部后，除去上清液，并加入 1 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （pH 7.6）。
   4. 再次重复步骤 6.4.3。
   5. 除去上清液，在PBS（pH 7.6）中加入1mL的4%甲醛，并将试管在4°C下轻轻摇动孵育过夜。
      注意:甲醛溶液中的样品可以在4°C下储存1周。
   6. 除去上清液，加入1mL-20°C甲醇，并将管在其侧面在-20°C孵育至少18小时。
      注意:样品可以在-20°C下储存1个月或更长时间。
   7. 除去上清液，加入 1 mL PDT 缓冲液（PBS 缓冲液中的 0.3% v/v Triton X-100、0.1% v/v 吐温-20 和 1% v/v 二甲基亚砜 [DMSO]）。
   8. 重复步骤6.4.7，并在室温下轻轻摇动管孵育管30分钟。
   9. 取出上清液，加入 1 mL 封闭缓冲液（10% v/v 热灭活胎牛血清 [FBS]、2% w/v 牛血清白蛋白 [BSA] 和 0.1% v/v 吐温-20 在 PBS 缓冲液中），并将试管在室温下温育 1 小时，轻轻摇动。
   10. 除去上清液，加入 200 μL 一抗溶液（在封闭缓冲液中稀释）。
   11. 取出上清液，加入500μL一抗溶液（在封闭缓冲液中稀释），并将试管在4°C下轻轻摇动孵育过夜。
       注意:如果使用新的一抗，则值得包括一些没有一抗染色的样品作为阴性对照。然而，理想情况下，吗啉基敲低或工程基因敲除胚胎，或靶蛋白表达受到刺激的胚胎，是验证抗体的更可靠手段。
   12. 取出上清液，加入 1 mL PDT 缓冲液，并在室温下轻轻摇动管孵育管 30 分钟。
   13. 重复步骤 6.4.12。
   14. 取出上清液，加入 1 mL 封闭缓冲液，并在室温下轻轻摇动管孵育管 1 小时。
       注意:此步骤后，应保护样品避光，以防止二抗上偶联的荧光团发生光漂白。
   15. 除去上清液，加入 200 μL 二抗溶液（在封闭缓冲液中稀释）。
   16. 取出上清液，加入 500 μL 二抗溶液（在封闭缓冲液中稀释），并将管在室温下温育 1.5 小时，轻轻摇动。
   17. 取出上清液，加入 1 mL PDT 缓冲液，并在室温下轻轻摇动管孵育管 30 分钟。
   18. 重复步骤 6.4.17。
   19. 将胚胎安装在2%琼脂糖板上（用PBS，pH 7.6制成），并用体视显微镜（明场和相应的荧光通道）对胚胎进行成像（图5A，B，D，F）。
       注意:如果使用徕卡M165 FC荧光体视显微镜，请使用25倍的放大倍率以获得分辨率良好的图像。
   20. 通过ImageJ（NIH）量化/分析荧光信号强度。使用 ImageJ 中的 手绘选择 工具量化感兴趣区域中的信号。

结果

Z-REX处理的转基因中性粒细胞/巨噬细胞报告鱼Tg（lyz:TagRFP）和Tg（mpeg1:EGFP）的实时成像。通过Keap1 HNE化诱导中性粒细胞/巨噬细胞凋亡。（另见图2）。通过注射源自Tg（lyz:TagRFP）或Tg（mpeg1:EGFP）的杂合转基因胚胎与编码Halo-Keap1的mRNA进行评估Keap1亲电标记对中性粒细胞和巨噬细胞水平的影响，然后用Ht-PreHNE（炔烃）处理。按照步骤6.1-下游测定的程序，释放选项1-HNE（炔烃）并标记Keap1。分别通过报告系Tg（lyz:TagRFP）和Tg（mpeg1:eGFP）的实时成像评估中性粒细胞和巨噬细胞水平。Z-REX处理后，两种细胞类型的水平都下降了30%-40%，其中HNE被递送到Keap1。相反，在Z-REX技术对照组中没有发现中性粒细胞或巨噬细胞的丢失[没有光和Ht-PreHNE（炔烃），单独光或单独使用Ht-PreHNE（炔烃）]（图1D和图2A-D）。

中性粒细胞/巨噬细胞凋亡的诱导表明HNE通过Z-REX成功递送到Keap1。有关途径分析和细胞凋亡机制的详细信息已发布⁵.为了解释HNE（炔烃）的脱靶效应，使用了几种对照。（1）在相同的实验条件下，代替Halo-TeV-Keap1 mRNA，注射Halo-P2A-Keap1 mRNA。P2A接头允许Halo和Keap1蛋白独立表达。在这种情况下，从Halo释放的HNE（炔烃）不能标记Keap1，因为它不再靠近Halo（图1D）;因此，细胞凋亡信号通路未被触发。在该组中未观察到巨噬细胞或中性粒细胞水平的变化（图2A，B）。（2）使用编码Halo-TeV-Keap1（C151S，C273W，C288E）的mRNA进行相同的实验条件，Keap1的突变体对HNE（炔烃）没有反应（图1D）。未观察到巨噬细胞或中性粒细胞水平的变化（图2G，H）。

生物素叠氮化物点击偶联和生物素下拉测定。目标标记评估。（另见图3）。使用WT胚胎进行靶标标记评估，注射编码Halo-TeV-Keap1-2xHA（Halo-POI融合构建体）或Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA（P2A分裂构建体，其中Halo和Keap1未融合的mRNA;图 1D）。标记的Keap1蛋白仅在表达融合蛋白的组中被拉下并用Z-REX（顶部抗HA印迹中的第二泳道）处理，但在其他对照组中没有被拉下（没有mRNA注射，没有Z-REX的融合构建体或P2A分裂构建体）。结果表明，HNE（炔烃）成功递送至Keap1，修饰的Keap1随后通过点击反应与生物素偶联，生物素标记的Keap1被链霉亲和素树脂拉下。

转录分析。RNA-seq和qRT-PCR。（另见图 4）。通过RNA-seq和qRT-PCR评估Z-REX处理后的转录变化。在RNA-seq中，几个免疫相关基因在Z-REX之后下调。相比之下，许多抗氧化反应（AR）相关基因在Z-REX之后上调，这是由于Keap1¹⁰上的HNE化诱导Keap1-Nrf2-AR途径引起的（图4A）。在qRT-PCR分析中，在分析三个免疫相关基因（lyz，mpeg1.1和coro1a）时发现了类似的结果（图4B）。各自基因的上调和下调显示Keap1 HNE化介导的途径的成功诱导。

全安装（共）免疫荧光染色测定和共定位分析。（另见图5）。通过全接口免疫荧光（IF）染色评估外源性Halo-TeV-Keap1-2xHA和Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA表达（图5A，B）。P2A分裂构建体的HA标签数量是TeV融合构建体的两倍，这相当于P2A分裂构建体mRNA注射组中的抗HA信号比另一个高两倍，表明两种构建体的表达水平相似（图5C）。在使用反晕探测时，Halo-TeV-Keap1（wt）和Halo-TeV-Keap1（C151S，C273W，C288E）的表达水平也相似（图5D，E）。通过抗RFP和抗活性半胱天冬酶3共免疫染色，观察到Z-REX处理的Tg（lyz:TagRFP）中嗜中性粒细胞和活性半胱天冬酶3的共定位（图5F）。活性半胱天冬酶3是细胞凋亡事件的指标。

图 1:Z-REX 工作流程。 （A，B）将1-4细胞阶段的斑马鱼胚胎注射（吗啉诺和）编码Halo-POI（例如Halo-Keap1）的mRNA。然后用由HaloTag配体和附有炔基团（例如B中的Ht-PreHNE（炔烃））的光笼亲电试剂组成的探针处理注射的胚胎。去除过量的探针后，将胚胎暴露在光线下以释放感兴趣的亲电试剂[例如，HNE或其类似物HNE（炔烃）]。下游分析在给定/用户定义的时间点执行。（C）Ht-PreLDE探针的设计和机理，适用于不同的脂质衍生亲电试剂（LDE）。（D）Z-REX的阴性/技术对照组。请点击此处查看此图的大图。

图2:接受Z-REX的转基因中性粒细胞/巨噬细胞报告鱼的实时成像。Z-REX介导的Keap1 HNE化诱导中性粒细胞/巨噬细胞凋亡。（A）表达Halo-TeV-Keap1（融合构建体）或Halo-P2A-Keap1（分裂构建体）的Tg（lyz:TagRFP）鱼的代表性图像，并经受阴性对照条件[不处理，单独光照，或单独使用Ht-PreHNE（炔烃）或Z-REX]。胚胎年龄:36马力。（B）A中性粒细胞水平的定量。（C）表达Halo-TeV-Keap1的Tg（mpeg1:eGFP）鱼的代表性图像，无论是否经过Z-REX处理。胚胎年龄:34马力。（D）C中巨噬细胞水平的定量。（中、女）Z-REX处理后（E）中性粒细胞和（F）巨噬细胞水平的时程测量。（G）在表达Halo-TeV-Keap1（WT）或Halo-TeV-Keap1（C151S，C273W，C288E）的鱼中进行的类似实验，这是一种不具有HNE感应能力的突变体。（H）G中性粒细胞水平的定量。比例尺:500 μm。所有图形均以平均± SEM表示。 p值使用单因素方差分析（蓝色）和双尾学生t检验（黑色）计算。这个数字是从Poganik等人7修改^的。请点击此处查看此图的大图。

图 3:生物素下拉测定。 表达Halo-TeV-Keap1-2XHA或Halo-2XHA-P2A-Keap1-2XHA的WT胚胎用Z-REX或相应的阴性对照条件处理（在这种情况下没有探针处理）。收获后，在生物素下拉测定之前裂解胚胎并用TeV蛋白酶处理。通过蛋白质印迹分析结果。这个数字是从黄等人修改而来的。 Z-REX:将反应性亲电试剂引导到组织特异性或普遍表达的特定蛋白质，并记录幼鱼中产生的功能性亲电试剂诱导的氧化还原反应。这个数字是从黄等人修改而来的。¹¹. 请点击此处查看此图的大图。

图4:转录分析。 （A）Z-REX处理的胚胎与未处理的胚胎的RNA-seq结果。突出显示具有统计学意义的差异表达（SDE）基因。免疫相关的SDE基因被涂成红色。抗氧化反应（AR）相关基因呈绿色。其他SDE基因是蓝色的。所有p值均使用CuffDiff计算。（乙-四）用qRT-PCR进一步分析了来自A的3个免疫相关SDE基因:（B）lyz，（C）mpeg1.1和（D）coro1a，只有Z-REX处理的胚胎显示出对这些转录本的抑制。所有图形均以平均± SEM表示，p值使用单因素方差分析（蓝色）和双尾学生t检验（黑色）计算。这个数字是从Poganik等人7修改^的。请点击此处查看此图的大图。

图 5:全安装免疫荧光染色测定 。 （A，B）表达（A）Halo-TeV-Keap1-2xHA或（B）用抗HA染色的Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA免疫染色和与AlexaFluor568偶联的二抗的胚胎的代表性图像。将mRNA注射的鱼与年龄匹配的非注射鱼进行比较。（C）（A，B）中抗HA信号的定量。（D）表达用抗晕免疫染色的Halo-TeV-Keap1（WT）或Halo-TeV-Keap1（C151S，C273W，C288E）的胚胎的代表性图像，并与AlexaFluor647偶联的二抗。将mRNA注射的鱼与年龄匹配的非注射鱼进行比较。（E） D中抗晕信号的量化。 p 值用双尾学生t检验计算。（六）对接受Z-REX的 Tg（lyz:TagRFP） 胚胎进行抗RFP和抗活性半胱天冬酶3以及相应的荧光团偶联二抗共免疫染色。白框标记放大的区域。白色箭头表示中性粒细胞和活性半胱天冬酶3的共定位。比例尺:500 μm。所有图表均以平均± SEM 表示。这个数字是从Poganik等人7修改^的。和黄等人。¹¹. 请点击此处查看此图的大图。

补充表1:本研究中使用的缓冲液列表。请点击此处下载此文件。

讨论

该协议中描述的Z-REX展示了活鱼中亲电目标对研究和信号通路反卷积的稳健策略。邻近导向的输送可实现亲电化合物处理的剂量和空间控制。与传统的推注给药方法不同，在传统的推注方法中，部署的超生理浓度的亲电试剂通常会导致脱靶问题，释放到系统中的相对少量的亲电试剂使Z-REX基本上是无创的。我们在斑马鱼胚胎中使用了0.1-6μM Ht-PreHNE（炔烃），结果表明该处理对胚胎发育无害¹¹。

Z-REX程序通常比T-REX长，T-REX是一种在培养细胞中筛选/研究亲电感应蛋白的技术。假设实验的目的是筛选亲电试剂-靶标相互作用;我们建议首先在培养的细胞中进行T-REX的广泛筛选，并使用Z-REX进行 体内 验证和表型/途径分析。与细胞培养相比，除了T-REX要求的生化实验技能外，进行Z-REX的要求是基本的鱼类饲养技术。Z-REX的典型时间范围（从鱼穿越到光诱导亲电试剂递送）为2-3天，这不超过转染活细胞T-REX实验的典型时间1天。光照明后2-10小时可以进行表型分析的实时成像;与生物素-叠氮化物进行下拉测定的点击偶联需要3天;用于测定转录反应的qRT-PCR需要3天;IF 染色需要 5 天。这些步骤与它们的细胞培养等效步骤大致相似，尽管数据的解释需要了解鱼类生理学和报告品系。

作为多变量程序12，Z-REX需要几个对照组来排除结果中的不确定性（图1D）。常见的对照组是:（1）仅DMSO/载体治疗;（2）探头处理，但无光照;（3）光照，但未经探头处理;（4）P2A分裂结构，其中Halo和POI分别表示，因此邻近递送被消融;（5）次态突变体，其亲电感应残基发生突变，例如Akt3（C119S）⁶和Keap1（C151S，C273W，C288E）⁵，我们在以前的研究中已经使用过。

如果下游检测涉及蛋白质印迹分析，则必须在收获前进行脱胎。卵黄蛋白会降低裂解物浓度评估的保真度，并可能与抗体非特异性结合。在进行活鱼成像或全安装IF染色时，我们还观察到卵黄囊中的非特异性荧光信号，可能是由卵黄囊中的自发荧光蛋白或抗体本身的非特异性结合引起的。如果自发荧光信号干扰信号，我们建议从定量中排除卵黄囊，或分别量化不同的区域。脱毛对于活鱼成像和全支架IF染色测定是必要的。绒毛膜会干扰成像，后来会干扰定量/细胞计数。但是，去绒毛脱落仅适用于年龄大于 1 dpf 的胚胎;处于胚芽/原肠胚形成/分割阶段的年轻胚胎太脆弱而无法去皮。

这里描述的Z-REX方案基于mRNA驱动的异位POI表达。与使用/生成转基因鱼系相比，该过程很快。mRNA 驱动的表达是普遍且瞬时的，对于本协议中使用的 mRNA，可持续至少 2 天。然而，在其他情况下，表达的持续时间可能会有所不同。因此，这种方法为特定亲电试剂标记事件的影响提供了一个快速且更全面的研究窗口，与几种高通量/高内涵测定兼容。在特定组织中具有稳定Halo-POI表达的转基因系也与Z-REX¹¹兼容。当需要提出更精确的问题时，例如，当从细胞培养数据预测特定器官中的表型时，或者当从mRNA注射实验中筛选预测特定器官对亲电标记事件敏感时，最好使用这种线。在我们之前的出版物¹¹中，使用Tg（gstp1:GFP;DsRed-P2A-myl7:Halo-TeV-Keap1）鱼证明了通过Z-REX诱导的心脏特异性抗氧化反应。也可以对年龄超过2 dpf的转基因鱼进行Z-REX。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol (BME)	Sigma-Aldrich	M6250
1.5-mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C-S
10-cm Petri dishes	Celltreat	229692
2-mL microcentrifuge tube	Axygen	MCT-200-C-S
30% Acrylamide and bis-acrylamide solution	BioRad	1610154
6-well plate	Celltreat	229506
Acetone	Fisher	A/0600/15
Agarose	GoldBio	A201-100
All Blue Prestained Protein Standards	BioRad	1610373
Ammonium persulfate	Sigma	A3678
Biotin-dPEG11-azide	Quanta Biodesign	102856-142
Bradford Dye	BioRad	5000205
BSA	Fisher	BP1600-100
Capillary tubes	VWR	HARV30-00200
Chloroform	Supelco, Inc	1.02445.1000
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836170001
Cu(TBTA)	Lumiprobe	21050
CuSO4	Sigma	209198
DMSO	Fisher	D128-500
Donkey anti-mouse-Alexa Fluor 647	Abcam	ab150107	1:800 (IF)
Donkey anti-rabbit-Alexa Fluor 647	Abcam	ab150075	1:1000 (IF)
Donkey anti-rat-AlexaFluor 568	Abcam	ab175475	1:1000 (IF)
ECL substrate	Thermo Fisher Scientific	32106
ECL-Plus substrate	Thermo Fisher Scientific	32132
End-to-end rotator	FinePCR	Rotator AG
Ethanol	Fisher	E/0650DF/15
Ethidium bromide	Sigma	E1510
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument Co.	P-97
Fluorescence stereomicroscope	Leica	M165 FC
Forceps (blunt)	self made		self made by blunting sharp forceps (Fine Science Tools, Dumont #5, 11252-40)
Forceps (sharp)	Fine Science Tools	Dumont #5, 11252-40
Gel loading tip	Fisher	02-707-181
Gel/blot imager	Vilber	Fusion FX imager
Glass beads	Sigma	45-G1145
Glass stage micrometer	Meiji Techno.	MA285
Heat inactivated FBS	Sigma	F2442
Heated ultrasonic bath	VWR	89375-470
HEPES	Fisher	BP310-1
High capacity streptavidin agarose	Thermo Fisher Scientific	20359
Ht-PreHNE alkyne probe	self-made	-	Parvez, S. et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).
Imaging plate (10% HBSS buffer, for live embryos)			Made with Petri dish, and 2% agarose in 10% HBSS buffer
Imaging plate (PBS, for formaldehyde-fixed embryos)			Made with Petri dish, and 2% agarose in PBS
Injection plate			Made with microinjection mold, Petri dish, and 2% agarose in 10% HBSS buffer
LDS	Apollo	APOBI3331
Methanol	VWR	20864.32
Microinjection mold	Adaptive Science Tools	TU-1
Microloader tips	Eppendorf	930001007
Micromanipulator	Narishige	MN-153
Microscope for micro-injection	Olympus	SZ61
Microscope light source	Olympus	KL 1600 LED
Mineral oil	Sigma	M3516
mMessage mMachine SP6 Transcription Kit	Ambion	AM1340
Mouse anti- β-actin-HRP	Sigma	A3854	1:20000 (WB)
Mouse anti-HaloTag	Promega	G921A	1:500 (IF)
Multi-mode reader	BioTek Instruments	Cytation 5
Nucleic acid agarose gel electrophoresis apparatus	Biorad	Mini-Sub Cell GT Systems
Oligo(dT)20	Integrated DNA Technologies	customized: (dT)20
Orange G	Sigma	O3756
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
PBS	Gibco	14190144
pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA	self-cloned	-	Available from Prof. Yimon AYE's group at EPFL
pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA	self-cloned	-	Available from Prof. Yimon AYE's group at EPFL
Pneumatic PicoPump	WPI	SYS-PV820
Protein electrophoresis equipment and supplies	Biorad	Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis
Rabbit anti-active Caspase-3	BD Pharmingen	559565	1:800 (IF)
Rat anti-HA-HRP	Sigma	H3663	1:500 (IF and WB)
Rat anti-RFP	ChromoTek	5F8	1:800 (IF)
Refrigerated centrifuge	Eppendorf	5417R
RNAseOUT recombinant ribonuclease inhibitor	ThermoFisher Scientific	10777019
RnaseZap RNA decontamination solution	ThermoFisher Scientific	AM9780
Rocking Shaker	DLAB	SK-R1807-S
SDS	Teknova	S9974
SuperScript III reverse transcriptase	ThermoFisher Scientific	18080085
t-Butanol	Sigma	471712
TCEP-HCl	Gold Biotechnology	TCEP1
TeV protease (S219V)	self-made	-	Parvez, S. et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).
Tg(lyz:TagRFP)	Zebrafish International Resource Center (ZIRC)	uwm11Tg (ZFIN)	-
Tg(mpeg1:eGFP)	Zebrafish International Resource Center (ZIRC)	gl22Tg (ZFIN)	-
Thermal cycler	Analytik Jana	846-x-070-280
TMEDA	Sigma	T7024
Transfer pipets	Fisher	13-711-9D
Tris	Apollo	APOBI2888
Triton X-100	Fisher	BP151-100
TRIzol reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)	Sigma	T9003
Tween 20	Fisher	BP337-500
UV lamp with 365-nm light	Spectroline	ENF 240C
UV meter	Spectroline	XS-365
Vortexer	Scientific Industries, Inc.	Vortex-Genie 2
Western Blotting Transfer equipment and supplies	Biorad	Mini Trans-Blot or Criterion Blotter
Zebrafish husbandry and breeding equipment			in house
Zirconia beads	BioSpec	11079107zx