评估接受生育力保留的年轻患者卵巢储备的 Z 评分

摘要

本方案描述了一种评估需要通过卵巢组织冷冻保存来保持生育能力的 25 岁以下患者的卵巢储备的方法。该方法涉及：（1） 皮质样本中卵巢储备的组织学评估，（2） 与参考数据集的比较，以及 （3） Z 分数的计算。

摘要

女性出生时有一个不可再生的卵巢卵泡库，称为卵巢储备。这种储备由卵巢中的原始卵泡组成，可能受到许多因素的影响，例如遗传和内分泌疾病、医疗干预和内分泌干扰物。当需要性腺毒性治疗时，建议保留生育能力。女性的首选选择是卵母细胞和胚胎冷冻保存。然而，对于非常年轻、性未成熟的患者，卵巢组织冷冻保存是唯一的选择。了解冷冻保存的组织样本的滤泡密度对于年轻患者的生育咨询至关重要。该协议演示了使用皮质卵泡密度的 Z 分数作为评估正在接受生育力保留的 25 岁及以下女孩和年轻女性卵巢组织质量的工具。将患者样本中的卵泡密度与 Hassan 等人开发的年龄标准化参考标准进行比较，以估计可能与标准的偏差。通过组织学定量测量卵泡密度。为此，将一小块卵巢皮质组织 （~2 mm x 2 mm x 2 mm） 固定在 Bouin 或甲醛溶液中，包埋在石蜡中，以 4 μm 的厚度切片，用苏木精和伊红染色，并使用载玻片扫描仪进行数字化。皮层中存在的卵泡阶段范围从原始卵泡到初级卵泡。皮质面积距组织学切片表面上皮 1 mm。使用 Schmidt 等人提出的修改后的公式计算卵泡密度，并使用参考平均值和标准差确定 Z 分数。Z 分数表示测量值与参考平均值的偏差程度，确定卵巢储备减少 （<-1.7 Z 分数）。通过这种方法，卵泡密度可以用作需要保留生育能力的年轻患者的卵巢储备的宝贵指标。

引言

卵巢是一个充满活力的、内分泌活跃的器官，由外皮层和内延髓组成。卵泡在卵巢内异质分布，其中包含被基质颗粒细胞包围的性腺卵母细胞¹。所有卵泡都在胎儿发育过程中形成，在胎龄 20 周左右达到顶峰，然后呈指数级下降。出生时，1-200 万个原始卵泡留在皮层内，只有几十万个卵泡存活到青春期²。非生长卵泡池，也称为卵巢储备，除其他因素外，会影响女性的生育能力。卵巢储备位于皮层内，并随着卵泡的生长和成熟而进入髓质。一些研究人员认为卵巢储备仅由原始卵泡组成，而另一些研究人员则包括所有单层卵泡（即原始卵泡、中间卵泡和原卵泡）3,4,5,6。在女性的一生中，只有 300-400 个卵泡成熟并存活并最终排卵。当卵泡数量下降到一千左右时，更年期开始，这通常发生在 50 岁左右 ^2,7。目前关于成人卵巢中存在卵干细胞 （OSC） 的争论仍在继续，这些细胞可以在异种移植后形成卵母细胞。一些研究表明分离表达原始生殖细胞基因图谱并分....

研究方案

所进行的所有程序均已获得瑞典伦理审查局（Sveafertil 患者，Dnr：2019-03802）和赫尔辛基大学医院伦理委员会（HCH 患者，Dnr 340/13/03/03/2015）的批准。研究护士提供有关该研究的书面和口头信息，并根据赫尔辛基宣言获得知情同意。对于 18 岁以下的患者，已获得法定监护人的知情同意。所有样本均采用假名化处理，并根据欧洲通用数据保护条例 （GDPR） 进行处理。本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 卵巢组织采集和处理

注意：当有不孕症高风险或极高风险的适应症时，按照当地指南（例如，北欧、欧洲或国际特定指南），确定所有符合保留生育能力条件的患者。在欧洲，仅招募未成年患者作为生育力保存研究计划的一部分。使用您所在国家/地区的生育力保存指南确定不孕症的风险。

1. 在全身麻醉下进行外科手术。静脉注射异丙酚 （2 mg/kg）、舒芬太尼 （0.5 μg/kg） 和罗库溴铵 （0.6 mg/kg） 以诱导麻醉。
   1. 以 6-8 mL/kg 的潮气量和 6-8 cm 的呼气正压 H₂O 为患者插管通气。 通过 气管插管输送 1% 至 2% 的七氟烷以维持吸入麻醉。

讨论

女性出生时卵母细胞库有限，无法补充。卵巢储备是女性生殖潜力的关键决定因素。本文概述了一种卵泡密度的组织学量化方法，以及使用年轻患者和 25 岁以下女性卵巢皮质卵泡密度的 Z 评分与参考标准的比较。

在该方案中，卵巢组织是从接受 OTC 以保持生育能力的不孕症高风险或极高风险的女孩和妇女或接受变性手术的患者那里获得的。使用一小?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	14190144
1x Phosphate Buffered Saline w/ CaCl2, MgCl2, 1 g/L D-glucose, 36 mg/L pyruvate	Thermo Fisher	14287-080
37% Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	1.09057.1000
70% ethanol	Histolabs	01370.01L
95% ethanol	Fisher scientific	10572143
Absolute ethanol	Histolabs	01399.01L
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132-1L
Eosin Y Free acid	Sigma-Aldrich	E4009-5G
Formaldehyde	Thermo Fisher	28908
Haematoxylin solution according to Delafield	Sigma-Aldrich	03971-250ML
ImageJ
Microsoft Excel
Microtome
Pertex mounting solution	Histolabs	00840-05
Propofol	Baxter Holding B.V.	N01AX10	ATC-code provided instead of catalog number
QuPath			https://qupath.github.io/
Rocuronium bromide	B. Braun Melsungen AG	M03AC09	ATC-code provided instead of catalog number
Scott's tap water substitute concentrate	Sigma-Aldrich	S5134-6x100ml
Sevoflurane	Baxter Medical AB	N01AB08	ATC-code provided instead of catalog number
Slide scanner
Sufentanil	Hameln Pharma gmbh	N01AH03	ATC-code provided instead of catalog number
Sugammadex	Baxter Holding B.V.	V03AB35	ATC-code provided instead of catalog number
SuperFrost plus white	Histolabs	06400
SuperFrost Plus White microscope slides	Histolabs	06400
Xylene	Saveen Werner	131769.1611