Z-критерий для оценки овариального резерва у молодых пациенток, находящихся на консервации фертильности

Резюме

В настоящем протоколе описан метод оценки овариального резерва у пациенток в возрасте до 25 лет, которым требуется сохранение фертильности путем криоконсервации ткани яичников. Этот метод включает в себя: (1) гистологическую оценку овариального резерва в образцах коры головного мозга, (2) сравнение с референсным набором данных и (3) расчет Z-баллов.

Аннотация

Женщины рождаются с невозобновляемым пулом фолликулов яичников, называемым овариальным резервом. Этот резерв состоит из примордиальных фолликулов в яичниках и может быть подвержен влиянию многих факторов, таких как генетические и эндокринные нарушения, медицинские вмешательства и эндокринные разрушители. Сохранение фертильности рекомендуется при необходимости гонадотоксического лечения. Предпочтительными вариантами для женщин являются криоконсервация ооцитов и эмбрионов. Тем не менее, у очень молодых, сексуально незрелых пациенток криоконсервация ткани яичников является единственным вариантом. Знание плотности фолликулов в криоконсервированных образцах тканей имеет важное значение в консультировании по вопросам фертильности для молодых пациентов. Этот протокол демонстрирует использование Z-показателей плотности кортикальных фолликулов в качестве инструмента для оценки качества ткани яичников у девушек и молодых женщин в возрасте 25 лет и младше, которые проходят процесс сохранения фертильности. Плотность фолликулов в образцах пациентов сравнивается с нормализованными по возрасту эталонными стандартами, разработанными Hassan et al. для оценки возможных отклонений от стандарта. Плотность фолликулов измеряется с помощью гистологической количественной оценки. Для этого небольшой кусочек кортикальной ткани яичников (~2 мм x 2 мм x 2 мм) фиксируют либо в растворе Буэна, либо в растворе формальдегида, погружают в парафин, разрезают на толщину 4 мкм, окрашивают гематоксилином и эозином и оцифровывают с помощью сканера предметных стекол. Фолликулярные стадии, присутствующие в коре головного мозга, варьируются от первичных до первичных фолликулов. Площадь коры головного мозга на гистологических срезах находилась на расстоянии 1 мм от поверхностного эпителия. Плотность фолликулов рассчитывается по модифицированной формуле, представленной Schmidt et al., а Z-оценка определяется с использованием референсного среднего и стандартного отклонения. Z-критерий показывает, насколько измеряемая величина отклоняется от референсного среднего, определяя сниженный (<-1,7 Z-критерий) овариальный резерв. С помощью этого метода плотность фолликулов может быть использована в качестве ценного показателя овариального резерва для молодых пациенток, нуждающихся в сохранении фертильности.

Введение

Яичник – динамичный, эндокринологически активный орган, состоящий из наружной коры и внутреннего мозгового вещества. В яичниках неоднородно распределены фолликулы, которые содержат гонадный ооцит, окруженный клетками стромальной гранулезы¹. Все фолликулы формируются уже во время внутриутробного развития, достигая пика примерно на 20 неделе гестационного возраста, за которым следует экспоненциальное снижение. При рождении 1-2 миллиона примордиальных фолликулов остаются в коре головного мозга, и только несколько сотен тысяч фолликулов доживают до^{полового} созревания 2. Нерастущий пул фоллик....

протокол

Все проведенные процедуры были одобрены Шведским органом по этическому надзору (пациенты Sveafertil, Dnr: 2019-03802) и Комитетом по этике Университетской больницы Хельсинки (пациенты HCH, Dnr 340/13/03/03/2015). Письменная и устная информация об исследовании была предоставлена медсестрами-исследователями, а также получено информированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией. Для пациентов младше 18 лет было получено информированное согласие законных опекунов. Все образцы были переведены в анонимную форму и обработаны в соответствии с Европейским общим регламентом по защите данных (GDPR). Подробная информация о реагентах....

Результаты

Фолликулы яичников количественно оцениваются после успешного разрезания, окрашивания и сканирования предметных стекол. Различаются различные стадии и состояние фолликулов и дополнительно анализируются. На рисунке 4А показан окрашенный HE поперечны?.......

Обсуждение

Женщины рождаются с ограниченным пулом ооцитов, который не может быть восполнен. Овариальный резерв является ключевым фактором, определяющим репродуктивный потенциал женщины. В данной статье представлен метод гистологической количественной оценки плотности фолли?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	14190144
1x Phosphate Buffered Saline w/ CaCl2, MgCl2, 1 g/L D-glucose, 36 mg/L pyruvate	Thermo Fisher	14287-080
37% Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	1.09057.1000
70% ethanol	Histolabs	01370.01L
95% ethanol	Fisher scientific	10572143
Absolute ethanol	Histolabs	01399.01L
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132-1L
Eosin Y Free acid	Sigma-Aldrich	E4009-5G
Formaldehyde	Thermo Fisher	28908
Haematoxylin solution according to Delafield	Sigma-Aldrich	03971-250ML
ImageJ
Microsoft Excel
Microtome
Pertex mounting solution	Histolabs	00840-05
Propofol	Baxter Holding B.V.	N01AX10	ATC-code provided instead of catalog number
QuPath			https://qupath.github.io/
Rocuronium bromide	B. Braun Melsungen AG	M03AC09	ATC-code provided instead of catalog number
Scott's tap water substitute concentrate	Sigma-Aldrich	S5134-6x100ml
Sevoflurane	Baxter Medical AB	N01AB08	ATC-code provided instead of catalog number
Slide scanner
Sufentanil	Hameln Pharma gmbh	N01AH03	ATC-code provided instead of catalog number
Sugammadex	Baxter Holding B.V.	V03AB35	ATC-code provided instead of catalog number
SuperFrost plus white	Histolabs	06400
SuperFrost Plus White microscope slides	Histolabs	06400
Xylene	Saveen Werner	131769.1611