Z-критерий для оценки овариального резерва у молодых пациенток, находящихся на консервации фертильности

Резюме

В настоящем протоколе описан метод оценки овариального резерва у пациенток в возрасте до 25 лет, которым требуется сохранение фертильности путем криоконсервации ткани яичников. Этот метод включает в себя: (1) гистологическую оценку овариального резерва в образцах коры головного мозга, (2) сравнение с референсным набором данных и (3) расчет Z-баллов.

Аннотация

Женщины рождаются с невозобновляемым пулом фолликулов яичников, называемым овариальным резервом. Этот резерв состоит из примордиальных фолликулов в яичниках и может быть подвержен влиянию многих факторов, таких как генетические и эндокринные нарушения, медицинские вмешательства и эндокринные разрушители. Сохранение фертильности рекомендуется при необходимости гонадотоксического лечения. Предпочтительными вариантами для женщин являются криоконсервация ооцитов и эмбрионов. Тем не менее, у очень молодых, сексуально незрелых пациенток криоконсервация ткани яичников является единственным вариантом. Знание плотности фолликулов в криоконсервированных образцах тканей имеет важное значение в консультировании по вопросам фертильности для молодых пациентов. Этот протокол демонстрирует использование Z-показателей плотности кортикальных фолликулов в качестве инструмента для оценки качества ткани яичников у девушек и молодых женщин в возрасте 25 лет и младше, которые проходят процесс сохранения фертильности. Плотность фолликулов в образцах пациентов сравнивается с нормализованными по возрасту эталонными стандартами, разработанными Hassan et al. для оценки возможных отклонений от стандарта. Плотность фолликулов измеряется с помощью гистологической количественной оценки. Для этого небольшой кусочек кортикальной ткани яичников (~2 мм x 2 мм x 2 мм) фиксируют либо в растворе Буэна, либо в растворе формальдегида, погружают в парафин, разрезают на толщину 4 мкм, окрашивают гематоксилином и эозином и оцифровывают с помощью сканера предметных стекол. Фолликулярные стадии, присутствующие в коре головного мозга, варьируются от первичных до первичных фолликулов. Площадь коры головного мозга на гистологических срезах находилась на расстоянии 1 мм от поверхностного эпителия. Плотность фолликулов рассчитывается по модифицированной формуле, представленной Schmidt et al., а Z-оценка определяется с использованием референсного среднего и стандартного отклонения. Z-критерий показывает, насколько измеряемая величина отклоняется от референсного среднего, определяя сниженный (<-1,7 Z-критерий) овариальный резерв. С помощью этого метода плотность фолликулов может быть использована в качестве ценного показателя овариального резерва для молодых пациенток, нуждающихся в сохранении фертильности.

Введение

Яичник – динамичный, эндокринологически активный орган, состоящий из наружной коры и внутреннего мозгового вещества. В яичниках неоднородно распределены фолликулы, которые содержат гонадный ооцит, окруженный клетками стромальной гранулезы¹. Все фолликулы формируются уже во время внутриутробного развития, достигая пика примерно на 20 неделе гестационного возраста, за которым следует экспоненциальное снижение. При рождении 1-2 миллиона примордиальных фолликулов остаются в коре головного мозга, и только несколько сотен тысяч фолликулов доживают до^{полового} созревания 2. Нерастущий пул фолликулов, также называемый овариальным резервом, влияет на фертильность женщины, среди других факторов. Овариальный резерв находится в коре головного мозга и перемещается в мозговое вещество по мере роста и созревания фолликулов. Некоторые исследователи признают, что овариальный резерв состоит только из первичных фолликулов, в то время как другие включают все униламинарные фолликулы (т.е. первичные, промежуточные и первичные)3,4,5,6. В течение жизни женщины созревает и выживает только 300-400 фолликулов, чтобы в конечном итоге подвергнуться овуляции. Менопауза начинается, когда количество фолликулов падает примерно до тысячи, что обычно происходит в возрасте^около 50 ^лет. В настоящее время продолжаются дебаты относительно наличия оогониальных стволовых клеток (ОСК) в яичниках взрослого человека, которые могут образовывать ооциты после ксенотрансплантации. Некоторые исследования предполагают выделение клеток, которые экспрессируют генный профиль примитивных половых клеток и дифференцируются в ооциты ^8,9, в то время как другие указывают на то, что предполагаемые OSC являются периваскулярными клетками кровеносных сосудов 10,11,12.

Преждевременная недостаточность яичников (ПОИ) определяется прекращением менструального цикла с повышением уровня ФСГ в возрасте до 40^лет13. Причины POI являются многофакторными и могут возникать идиопатически; Тем не менее, он часто возникает в результате медицинских состояний¹⁴. Например, некоторые врожденные генетические заболевания связаны с POI из-за сниженного овариального резерва уже при рождении, такие как синдром Тернера¹⁵. POI также может возникать в качестве побочного эффекта гонадотоксичного лечения, что особенно проблематично у очень молодых пациенток, поскольку это может привести к неспособности пройти нормальное половое созревание и резко ухудшить овариальный резерв. В зависимости от риска POI и возраста пациента доступно несколько вариантов сохранения фертильности, таких как криоконсервация зрелых ооцитов, криоконсервация эмбрионов после экстракорпорального оплодотворения и криоконсервация ткани яичников (OTC). Для пациентов препубертатного возраста безрецептурный режим является единственным возможным вариантом из-за их сексуальной незрелости^16,17. В Соединенных Штатах сохранение фертильности с помощью безрецептурных препаратов в последнее время считается приемлемой клинической процедурой¹⁸. Тем не менее, безрецептурные препараты до сих пор считаются экспериментальными во многих европейских странах, и требуется этическое одобрение, особенно для аутотрансплантации^. Поэтому критерии включения в безрецептурные протоколы должны быть тщательно проработаны, а для каждого пациента должен быть проведен анализ риска и пользы. Не все дети, получающие гонадотоксичную терапию, имеют право на сохранение фертильности. В Швеции только пациентам с высоким или очень высоким риском рекомендуется проходить процедуру сохранения фертильности в соответствии с рекомендациями по сохранению фертильности Северного общества детской гематологии и онкологии²¹. В эту группу входят (1) дети до и после полового созревания, нуждающиеся в трансплантации стволовых клеток или получающие лучевую терапию с яичником в области диапазона, и (2) дети постпубертатного возраста с высокими кумулятивными дозами алкилирующей химиотерапии. Для девочек до менархе критерии включения с очень высоким риском бесплодия включают тех, кто получает любую из следующих доз: дозу облучения яичников >10 Гр или аллогенную или аутологичную терапию гемопоэтическими стволовыми клетками (ТГСК). К критериям исключения относятся те, кто нуждается в дополнительных продуктах крови для других антикоагулянтных препаратов перед операцией или имеет количество нейтрофилов <1. Для девочек/женщин после менархе критерии включения в группу с высоким или очень высоким риском бесплодия включают тех, кто получал любую из следующих доз: доза облучения яичников >10 Гр, или аллогенная ТГСК, циклофосфамид >9 г/м², ифосфамид >60 г/м², прокарбазин или соединения нитрозомочевины (BCNU/CCNU) >360 мг/м². Критерии исключения включают тех, кто имеет повышенный риск кровотечения, повышенный риск инфекции, повышенный риск хирургических осложнений или повышенный риск проблем с болью по оценке лечащего врача.

При безрецептурных препаратах ткань яичников собирают во время операций на брюшной полости с помощью лапаротомии или лапароскопии посредством односторонней овариэктомии или биопсии. Мозговое вещество удаляют из собранной ткани яичника, а оставшуюся кору затем разрезают на более мелкие фрагменты для криоконсервации с помощью контролируемой скорости замораживания или витрификации для последующего использования^{при восстановлении} фертильности. Затем образцы хранятся в жидком азоте до тех пор, пока пациентка не оправится от лечения и не захочет создать семью. В зависимости от типа рака и при отсутствии противопоказаний к трансплантации ткани яичника, ткань затем размораживается и аутотрансплантируется для восстановления гормонального фона и функции яичников. Безрецептурные препараты оказались успешными: 50% случаев наступления беременности и более 200 живорождений после пересадки криоконсервированной ткани яичников, собранной во взрослом возрасте, 23,24,25. Зарегистрированных случаев живорождения после аутотрансплантации ткани яичников, собранной в детстве, немного, и ни одного из них не было зарегистрировано после аутотрансплантации, несомненно, препубертатной ткани яичников 26,27,28,29,30. Качество тканей является предпосылкой для успешного восстановления фертильности³¹. Поэтому важно изучить качество собранных образцов тканей.

В настоящее время одним из способов оценки качества ткани яичников является гистологические срезы и ручной подсчет фолликулов. Однако оценка нормальности плотности фолликулов затруднена из-за естественного снижения резерва с увеличением возраста и неоднородного распределения фолликулов. Кроме того, сравнение с референсными значениями является сложной задачей, поскольку они не стандартизированы по размеру и возрасту биопсии. Другие варианты оценки, такие как уровень АМГ в сыворотке крови или окрашивание переваренной ткани кальцеином или нейтральным красным цветом, либо не очень хорошо известны, либо имеют свои собственные ограничения. Уоллес и Келси ранее опубликовали модель нормального овариального резерва с возрастом, собрав данные о количестве фолликулов из цельных яичников пациенток без известных патологий^{яичников.} Кроме того, поскольку биопсия не является репрезентативной для всего яичника, Schmidt et al. разработали метод оценки общего количества фолликулов на основе биопсии коры головного мозга³². С помощью модифицированной версии этого метода и модели нормального овариального резерва был создан референсный набор данных по плотности фолликулов женщин в возрасте 0-25^лет33.

В данной статье описана стратегия оценки нормальности плотности фолликулов на основе небольших образцов яичников путем (1) прямой количественной оценки фолликулов с помощью гистологии и (2) сравнения результатов с нормализованными по возрасту стандартными показателями с помощью Z-показателей. Использование Z-оценок описывает связь плотности фолликулов биопиколов яичников со средним значением стандартизированной референтной группы по возрасту и размеру. Это будет иметь большое значение для врачей при консультировании своих пациентов по поводу аутотрансплантации и дальнейшего лечения после сохранения фертильности.

протокол

Все проведенные процедуры были одобрены Шведским органом по этическому надзору (пациенты Sveafertil, Dnr: 2019-03802) и Комитетом по этике Университетской больницы Хельсинки (пациенты HCH, Dnr 340/13/03/03/2015). Письменная и устная информация об исследовании была предоставлена медсестрами-исследователями, а также получено информированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией. Для пациентов младше 18 лет было получено информированное согласие законных опекунов. Все образцы были переведены в анонимную форму и обработаны в соответствии с Европейским общим регламентом по защите данных (GDPR). Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Забор и обработка ткани яичников

ПРИМЕЧАНИЕ: Определите всех пациентов, отвечающих критериям для сохранения фертильности, когда есть показания к высокому или очень высокому риску бесплодия, в соответствии с местными рекомендациями (например, скандинавскими, европейскими или международными специальными рекомендациями). В Европе набирают несовершеннолетних пациентов только в рамках исследовательских программ по сохранению фертильности. Определите риск бесплодия, используя рекомендации вашей страны по сохранению фертильности.

1. Проведите хирургическое вмешательство под общим наркозом. Введите внутривенно пропофол (2 мг/кг), суфентанил (0,5 мкг/кг) и рокурония бромид (0,6 мг/кг) для индукции анестезии.
   1. Интубируйте и проведите вентиляцию легких пациента с дыхательным объемом 6-8 мл/кг и положительным давлением выдоха 6-8 см от_Н2О. Подайте севофлуран в 1-2% через эндотрахеальную трубку для поддержания ингаляционной анестезии.
   2. Поддерживайте нервно-мышечную блокаду с помощью рокурония бромида (0,15 мг/кг) во время хирургической процедуры для обеспечения адекватного расслабления мышц и проведения лапароскопии при более низком внутрибрюшном инсуффляционном давлении.
   3. Используйте биспектральный индекс для определения глубины анестетика, чтобы способствовать быстрому пробуждению при уменьшенной дозе анестетика. Противодействовать остаточному нервно-мышечному блоку сугаммадексом (2-4 мг/кг).
2. Используя трехпортовую технику, введите троакар диаметром 10 мм в брюшную полость в области пупка, чтобы ввести оптическую линзу с прикрепленной камерой, и два троакара диаметром 5 мм в левую и правую подвздошные области (на 2 см выше и на 2 см медиально по отношению к соответствующему переднему верхнему подвздошному отделу позвоночника) под прямым наблюдением для хирургического инструментария и забора тканей. Осмотрите органы малого таза, включая оба яичника, чтобы подтвердить норму.
   1. Определите яичник, к которому легче всего получить доступ, затем возьмитесь за него. Отрежьте объем, который составляет примерно одну треть яичника (или как указано в вашем этическом разрешении), затем при необходимости используйте диатермию для обеспечения гемостаза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите биопсию только в том случае, если нет противопоказаний, таких как факторы риска чрезмерного внутри- или послеоперационного кровотечения или повышенный риск инфекции. Четко укажите и следуйте критериям включения и исключения страны. Весь яичник может быть взят, если риск бесплодия очень высок и/или риск разрезания только части считается слишком высоким (например, из-за кровотечения). Избегайте использования диатермии перед сбором образца, так как это может повредить ткань.
3. Находясь в операционной, поместите ткань в пробирку, содержащую 5 мл 1 фосфатного буферного раствора Дульбекко (PBS) с CaCl₂, MgCl₂, 1 г/л D-глюкозы, 36 мг/л пирувата, либо подогретую до 37 °C, если образец немедленно обрабатывается в лаборатории (в течение 30 минут), либо при длительной транспортировке (до 24 часов) при температуре 4 °C.
   Примечание: Решения для транспортировки включают в себя ряд коммерчески доступных решений для транспортировки/перфузии органов, а также простые буферы, такие как PBS и MEM³⁴.
4. Отрежьте небольшой кусочек ткани яичника (2 мм х 2 мм х 2 мм) от поверхности яичника. Эта часть содержит кору головного мозга, которая является внешней частью яичника, где находятся фолликулы яичников³⁵.
   ВНИМАНИЕ: Обрабатывайте человеческие ткани, такие как яичник, используя методы и процедуры уровня биобезопасности 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Специализированное отделение репродуктивной медицины клинически криоконсервирует остальную ткань яичников для потенциального будущего использования в восстановлении фертильности пациентов.
5. Поместите салфетку в раствор Буэна с концентрацией 350 мкл при комнатной температуре на 2 ч или в 350 мкл 4% формальдегида при температуре 4 °C на ночь, убедившись, что ткань полностью погружена в воду. После инкубации промойте ткань с 70% этанолом три раза.
   1. Для раствора Буина умывайтесь до исчезновения желтого цвета. Погрузите ткань в парафин³⁶. Вырежьте минимум 30 серийных участков ткани толщиной 4 мкм и поместите их на предметные стекла.
      ВНИМАНИЕ: Обрабатывайте раствор Буэна и формальдегид в химическом колпаке и с надлежащими защитными средствами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формальдегид может привести к образованию артефактов в ткани, связанных с усадкой. Таким образом, решение Буэна является предпочтительным выбором для сохранения гистологии. Тем не менее, решение Буэна несет в себе дополнительные риски, что приводит к тому, что некоторые учреждения предпочитают использовать формальдегид³⁷.

2. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

1. Взвесьте 5 г порошка эозина Y в автоклавный стеклянный флакон объемом 100 мл. Добавьте 800 мл 95% этанола и 200 мл деионизированной воды, чтобы получить 0,5% исходный раствор эозина. Приготовьте рабочий раствор 0,25% эозина, разбавив 200 мл 0,5% стокового раствора эозина 160 мл 100% этанола, 1 мл уксусной кислоты и 40 мл деионизированной воды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Порошок должен раствориться не полностью. Отфильтруйте раствор перед использованием, чтобы уменьшить количество осадков.
2. Разместите горки в стеллажах. Погрузите стеллаж с предметными стеклами в соответствующие емкости в следующем порядке: 15 мин в ксилол, 5 мин в 100% этанол, 10 раз опустить в 70% этанол, 10 раз опустить в 50% этанол, а затем 10 раз опустить в деионизированную воду.
   1. Погрузите стеллаж с предметными стеклами в раствор гематоксилина на 3 мин, затем переложите стеллаж с предметными стеклами в емкость с дистиллированной водопроводной водой на 30 с, чтобы смыть излишки пятна гематоксилином.
   2. Поместите стеллаж со слайдами в емкость с дифференцирующим раствором (1 мл 37% HCl добавлено к 100 мл 70% этанола) на 1 мин, затем переложите стеллаж со слайдами в емкость с дистиллированной водопроводной водой на 30 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что срезы ткани погружены в жидкость. При необходимости добавьте в контейнер еще реагента. Меняйте ксилол через каждые 5 использований при окрашивании больших количеств. Приготовьте 50% этанол путем разбавления 70% этанола (например, добавьте 35 мл 70% этанола к 15 мл DPBS, чтобы получить 50 мл 50% этанола).
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с ксилолом в капюшоне и с надлежащими защитными средствами.
3. Поместите решетку со слайдами в водопроводную воду Скотта (также известную как раствор воронения) на 30-60 с, затем переложите решетку с горками в емкость с дистиллированной водой из-под крана на 30 с. Погрузите штатив со слайдами в рабочий раствор эозина на 1 мин.
   1. Обезвоживайте предметные стекла, поместив их в следующие реагенты: 100% этанол на 30 с, второй контейнер со 100% этанолом на 30 с, а затем дважды опустите в ксилол. После извлечения решетки из раствора ксилола дайте ей высохнуть в стеклянной емкости, чтобы ксилол не капнул внутрь вытяжки.
   2. Закрепите слайд с помощью 2 капель монтажного раствора. Осторожно установите защитные стекла, чтобы избежать образования пузырей и дать монтажному раствору высохнуть.
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с ксилолом в капюшоне и с надлежащими защитными средствами.
4. Оцифруйте слайды, по возможности отсканировав их с помощью сканеров слайдов. Если такой вариант недоступен, используйте обычный инвертированный микроскоп с 20-40-кратным увеличением для прямого подсчета фолликулов. Обязательно сделайте снимок всей биопсии, чтобы облегчить измерение площади в программном обеспечении для анализа изображений.

3. Подсчет фолликулов

1. Если слайды были оцифрованы, откройте файлы с помощью соответствующего программного обеспечения (например, программного обеспечения с открытым исходным кодом QuPath³⁸). Если анализ не оцифрован, выполните его непосредственно с помощью инвертированного микроскопа и соответствующего программного обеспечения.
   1. Перетащите файл в главное окно QuPath. Установите тип изображения на Brightfield H&E (см. рис. 1A). Определите эпителий на расстоянии 1 мм от поверхности (один слой кубовидных клеток, выстилающих поверхность) с помощью масштабной линейки. Нажмите на инструмент «Эллипс» и аннотируйте фолликулы (см. Рисунок 1B).
   2. Подсчитайте количество фолликулов в пределах этой области размером 1 мм, от примордиальной до первичной стадии. Определить стадию каждого фолликула (первичная – слой уплощенных гранулезных клеток, окружающих ооцит; промежуточная стадия – смесь уплощенных и кубовидных гранулезных клеток; первичная – один полный слой кубовидных гранулезных клеток, окружающих ооцит).
   3. Введите идентификатор образца, возраст, количество фолликулов для каждого предметного стекла, толщину среза и^n-й срез, подсчитанный в лист с именем Фолликул в мм³ в файле Excel калькулятора Z-оценки фолликулов (см. Дополнительный файл 1 и Рисунок 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за диаметра фолликулов (самых маленьких фолликулов >35 мкм) один и тот же фолликул может появляться на последовательных участках. Соблюдайте особую осторожность при подсчете участков, расстояние между которыми меньше диаметра фолликула. Предпочтительно подсчитывать фолликулы из каждого^10-го отдела (например, из отдела #10, #20, #30). Поверхностный эпителий может отслаиваться во время обработки тканей и может присутствовать на предметных стеклах лишь частично. Подсчитывают только фолликулы с видимой цитоплазмой. Для контроля качества попросите двух человек независимо друг от друга посчитать фолликулы и определить, насколько хорошо их количество совпадает. Рассчитайте согласованность между наблюдателями с помощью простой корреляционной функции между количеством фолликулов каждого наблюдателя для одного и того же образца.
2. Определите самые большие 10% фолликулов в каждом подсчитанном участке с помощью глазного яблока. Измерьте средний диаметр этих ооцитов, щелкнув по инструменту «Линия », проведя две перпендикулярные линии через мембрану ооцита и выбрав «Измерить», а затем «Показать измерения аннотации » (см. рисунок 1C).
   1. Запишите измерения в столбце Длина μм (см. Рисунок 1D). Введите средний диаметр всех ооцитов в поле Средний диаметр ооцитов (мкм) для каждого слайда в файле Excel калькулятора Z-оценки фолликулов (Фолликул в мм³, см. Дополнительный файл 1 и Рисунок 2A).
3. Поместите изображение в центр экрана в QuPath, затем нажмите на значок ImageJ . Выберите Send snapshot to ImageJ (см. рис. 3A). В ImageJ разграничьте границу на расстоянии 1 мм с помощью инструмента «Кисть ». Нажмите на изображение, затем на Type и выберите 8-бит (см. рисунок 3B).
   1. Нажмите на инструмент «Линия », нарисуйте линию на масштабной линейке в левом нижнем углу экрана (см. Рисунок 3C). Нажмите « Анализ», затем «Установить масштаб», введите длину, указанную на масштабной линейке в поле «Известное расстояние», и нажмите « ОК» (см. рисунок 3C). Нажмите на Изображение, затем Настройка, Яркость/Контрастность и выберите Авто (см. Рисунок 3D).
   2. Нажмите на Изображение, затем Настройка, Порог и выберите Авто (см. Рисунок 3E). Кликните по инструменту-палочке , выделите область, затем нажмите Ctrl + M (см. Рисунок 3F). Введите значение площади в файл Excel калькулятора Z-оценки фолликула (фолликул в мм³, см. дополнительный файл 1 и рисунок 2A).

4. Расчет плотности фолликулов, объема коры головного мозга и Z-оценки

1. Используйте прилагаемый файл Excel калькулятора Z-оценки фолликулов для автоматического выполнения расчетов, описанных ниже. Результаты появятся на листе «Z-score (фолликул на мм³)» в калькуляторе Excel (см. Дополнительный файл 1) при условии, что данные, указанные в разделе 3, будут внесены в лист «фолликулы в мм³».
2. Для расчета плотности фолликулов в этих срезах используйте модифицированную формулу, представленную Schmidt et ^al.32. Во-первых, примените поправочный коэффициент α для учета двойного подсчета одного и того же фолликула. Модифицированная формула выглядит следующим образом:
   
   
   Примечание: В этой формуле t — толщина среза, d — диаметр ооцита, а q — частное от диаметра фолликула, деленное на толщину среза.
3. Экстраполируйте общее количество фолликулов (n _{фолликулов}) в коре головного мозга из количества фолликулов в срезе по следующей формуле³³:
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта формула также учитывает все невычисляемые разделы. Здесь γ представляет собой количество секций, которые не были рассчитаны (например, γ = 10, если учитывается каждый^10-й секция), α — поправочный коэффициент, рассчитанный в 4,1, N — количество подсчитанных секций, а n _i — общее количество фолликулов в подсчитанных секциях.
   1. Экстраполируйте весь объем коры головного мозга (V) из подсчитанных областей по следующей формуле³³:
      
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь A_i — это площадь разреза, а t_i — толщина ткани. Пожалуйста, проверьте шаг 4.2 на предмет γ и N.
   2. Используйте следующую формулу³³ для расчета плотности фолликулов:
      
4. Определить, есть ли сниженный (<-1,7 Z-score) овариальный резерв, рассчитав Z-показатель по формуле³³:
   
   ПРИМЕЧАНИЕ: Z-оценка автоматически рассчитывается на листе «Z-оценка (фолликул на мм³)» в калькуляторе Excel (см. Дополнительный файл 1) на основе информации, представленной в разделе 3 (Подсчет фолликулов) (Рисунок 2B). В этой формуле Z представляет Z-оценку, x — расчетную плотность фолликулов (фолликулы/^см3) исследуемой выборки (шаг 4.4), M — среднюю плотность фолликулов соответствующей возрастной группы, а SD — стандартное отклонение соответствующей возрастной группы. Референсные значения для женщин в возрасте от 0 до 25 лет были установлены в работе Hassan et ^al.33. Средние значения и стандартные отклонения плотности фолликулов соответствующих возрастных групп можно найти в файле Excel калькулятора Z-оценки фолликулов (Дополнительный файл 1) и использовать для расчета Z-оценки.

Результаты

Фолликулы яичников количественно оцениваются после успешного разрезания, окрашивания и сканирования предметных стекол. Различаются различные стадии и состояние фолликулов и дополнительно анализируются. На рисунке 4А показан окрашенный HE поперечны?...

Обсуждение

Женщины рождаются с ограниченным пулом ооцитов, который не может быть восполнен. Овариальный резерв является ключевым фактором, определяющим репродуктивный потенциал женщины. В данной статье представлен метод гистологической количественной оценки плотности фолли?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	14190144
1x Phosphate Buffered Saline w/ CaCl2, MgCl2, 1 g/L D-glucose, 36 mg/L pyruvate	Thermo Fisher	14287-080
37% Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	1.09057.1000
70% ethanol	Histolabs	01370.01L
95% ethanol	Fisher scientific	10572143
Absolute ethanol	Histolabs	01399.01L
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132-1L
Eosin Y Free acid	Sigma-Aldrich	E4009-5G
Formaldehyde	Thermo Fisher	28908
Haematoxylin solution according to Delafield	Sigma-Aldrich	03971-250ML
ImageJ
Microsoft Excel
Microtome
Pertex mounting solution	Histolabs	00840-05
Propofol	Baxter Holding B.V.	N01AX10	ATC-code provided instead of catalog number
QuPath			https://qupath.github.io/
Rocuronium bromide	B. Braun Melsungen AG	M03AC09	ATC-code provided instead of catalog number
Scott's tap water substitute concentrate	Sigma-Aldrich	S5134-6x100ml
Sevoflurane	Baxter Medical AB	N01AB08	ATC-code provided instead of catalog number
Slide scanner
Sufentanil	Hameln Pharma gmbh	N01AH03	ATC-code provided instead of catalog number
Sugammadex	Baxter Holding B.V.	V03AB35	ATC-code provided instead of catalog number
SuperFrost plus white	Histolabs	06400
SuperFrost Plus White microscope slides	Histolabs	06400
Xylene	Saveen Werner	131769.1611