Puntuaciones Z para la evaluación de la reserva ovárica en pacientes jóvenes sometidas a preservación de la fertilidad

Resumen

El presente protocolo describe un método para evaluar la reserva ovárica en pacientes menores de 25 años que requieren preservación de la fertilidad mediante criopreservación de tejido ovárico. Este método implica: (1) la evaluación histológica de la reserva ovárica en muestras corticales, (2) la comparación con un conjunto de datos de referencia y (3) el cálculo de las puntuaciones Z.

Resumen

Las mujeres nacen con un grupo no renovable de folículos ováricos, lo que se conoce como reserva ovárica. Esta reserva está formada por folículos primordiales de los ovarios y puede verse afectada por muchos factores, como trastornos genéticos y endocrinos, intervenciones médicas y disruptores endocrinos. Se recomienda la preservación de la fertilidad cuando son necesarios tratamientos gonadotóxicos. Las opciones preferidas para las mujeres son la criopreservación de ovocitos y embriones. Sin embargo, en pacientes muy jóvenes y sexualmente inmaduras, la criopreservación de tejido ovárico es la única opción. Conocer la densidad folicular de las muestras de tejido criopreservado es esencial en el asesoramiento sobre fertilidad de pacientes jóvenes. Este protocolo demuestra el uso de puntuaciones Z para la densidad del folículo cortical como herramienta para evaluar la calidad del tejido ovárico en niñas y mujeres jóvenes de 25 años o menos que están en proceso de preservación de la fertilidad. La densidad de folículos en muestras de pacientes se compara con los estándares de referencia normalizados por edad, desarrollados por Hassan et al. para estimar las posibles desviaciones del estándar. La densidad del folículo se mide a través de la cuantificación histológica. Para ello, se fija un pequeño trozo de tejido cortical ovárico (~2 mm x 2 mm x 2 mm) en solución de Bouin o de formaldehído, se incrusta en parafina, se secciona a 4 μm de grosor, se tiñe con hematoxilina y eosina y se digitaliza con un escáner de portaobjetos. Las etapas foliculares presentes en la corteza van desde los folículos primordiales hasta los primarios. El área cortical estaba a 1 mm del epitelio superficial en los cortes histológicos. La densidad de folículos se calcula utilizando una fórmula modificada presentada por Schmidt et al., y la puntuación Z se determina utilizando la media de referencia y la desviación estándar. La puntuación Z indica cuánto se desvía el valor medido de la media de referencia, determinando la reserva ovárica reducida (<-1,7 puntuación Z). Con este método, las densidades de los folículos se pueden utilizar como una medida valiosa de la reserva ovárica para pacientes jóvenes que requieren preservación de la fertilidad.

Introducción

El ovario es un órgano dinámico, endocrinológicamente activo, formado por una corteza externa y una médula interna. Dentro de los ovarios se distribuyen heterogéneamente los folículos, que contienen el ovocito gonadal rodeado de células estromales de la granulosa¹. Todos los folículos ya se forman durante el desarrollo fetal, alcanzando su punto máximo alrededor de las 20 semanas de edad gestacional, seguido de una disminución exponencial. Al nacer, 1-2 millones de folículos primordiales permanecen dentro de la corteza, y solo unos pocos cientos de miles de folículos sobreviven hasta la pubertad

Protocolo

Todos los procedimientos realizados fueron aprobados por la Autoridad Sueca de Revisión Ética (pacientes de Sveafertil, Dnr: 2019-03802) y por el Comité de Ética del Hospital Universitario de Helsinki (pacientes con HCH, Dnr 340/13/03/03/2015). Las enfermeras investigadoras proporcionaron información escrita y oral sobre el estudio y se obtuvo el consentimiento informado de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Para los pacientes menores de 18 años, se obtuvo el consentimiento informado de los tutores legales. Todas las muestras fueron seudonimizadas y procesadas de acuerdo con el Reglamento General de Protección de Datos (RGPD) eur....

Resultados

Los folículos ováricos se cuantifican después de una sección, tinción y escaneo exitosos de los portaobjetos. Se distinguen y analizan las diferentes etapas y la salud de los folículos. En la Figura 4A, se muestra una sección transversal teñida con HE de un ovario fijado a Bouin de un adulto, con ejemplos de tejido cortical y medular. La figura 4B muestra una imagen representativa del ovario de un niño con un ejemplo de.......

Discusión

Las mujeres nacen con un grupo finito de ovocitos, que no se pueden reponer. La reserva ovárica es un determinante clave del potencial reproductivo de una mujer. En este artículo se describe un método para la cuantificación histológica de la densidad folicular y su comparación con los estándares de referencia utilizando puntuaciones Z de las densidades de folículos corticales ováricos en pacientes jóvenes y mujeres de hasta 25 años de edad.

En este .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	14190144
1x Phosphate Buffered Saline w/ CaCl2, MgCl2, 1 g/L D-glucose, 36 mg/L pyruvate	Thermo Fisher	14287-080
37% Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	1.09057.1000
70% ethanol	Histolabs	01370.01L
95% ethanol	Fisher scientific	10572143
Absolute ethanol	Histolabs	01399.01L
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132-1L
Eosin Y Free acid	Sigma-Aldrich	E4009-5G
Formaldehyde	Thermo Fisher	28908
Haematoxylin solution according to Delafield	Sigma-Aldrich	03971-250ML
ImageJ
Microsoft Excel
Microtome
Pertex mounting solution	Histolabs	00840-05
Propofol	Baxter Holding B.V.	N01AX10	ATC-code provided instead of catalog number
QuPath			https://qupath.github.io/
Rocuronium bromide	B. Braun Melsungen AG	M03AC09	ATC-code provided instead of catalog number
Scott's tap water substitute concentrate	Sigma-Aldrich	S5134-6x100ml
Sevoflurane	Baxter Medical AB	N01AB08	ATC-code provided instead of catalog number
Slide scanner
Sufentanil	Hameln Pharma gmbh	N01AH03	ATC-code provided instead of catalog number
Sugammadex	Baxter Holding B.V.	V03AB35	ATC-code provided instead of catalog number
SuperFrost plus white	Histolabs	06400
SuperFrost Plus White microscope slides	Histolabs	06400
Xylene	Saveen Werner	131769.1611