Escores Z para avaliação da reserva ovariana em pacientes jovens submetidos à preservação da fertilidade

Resumo

O presente protocolo descreve um método para avaliar a reserva ovariana em pacientes com menos de 25 anos que necessitam de preservação da fertilidade por meio da criopreservação do tecido ovariano. Este método envolve: (1) avaliação histológica da reserva ovariana em amostras corticais, (2) comparação com um conjunto de dados de referência e (3) cálculo de escores Z.

Resumo

As mulheres nascem com um pool não renovável de folículos ovarianos, conhecido como reserva ovariana. Essa reserva consiste em folículos primordiais nos ovários e pode ser afetada por muitos fatores, como distúrbios genéticos e endócrinos, intervenções médicas e desreguladores endócrinos. A preservação da fertilidade é recomendada quando tratamentos gonadotóxicos são necessários. As opções preferidas para as mulheres são a criopreservação de oócitos e embriões. No entanto, em pacientes muito jovens e sexualmente imaturas, a criopreservação do tecido ovariano é a única opção. Conhecer a densidade folicular de amostras de tecido criopreservado é essencial no aconselhamento de fertilidade para pacientes jovens. Este protocolo demonstra o uso de escores Z para densidade folicular cortical como uma ferramenta para avaliar a qualidade do tecido ovariano em meninas e mulheres jovens com 25 anos ou menos que estão em preservação da fertilidade. A densidade folicular em amostras de pacientes é comparada aos padrões de referência normalizados por idade, desenvolvidos por Hassan et al. para estimar possíveis desvios do padrão. A densidade do folículo é medida por meio de quantificação histológica. Para isso, um pequeno pedaço de tecido cortical ovariano (~ 2 mm x 2 mm x 2 mm) é fixado em solução de Bouin ou formaldeído, embebido em parafina, seccionado com 4 μm de espessura, corado com hematoxilina e eosina e digitalizado usando um scanner de lâminas. Os estágios foliculares presentes no córtex variam de folículos primordiais a primários. A área cortical foi de 1 mm do epitélio superficial nos cortes histológicos. A densidade folicular é calculada usando uma fórmula modificada apresentada por Schmidt et al., e o escore Z é determinado usando a média de referência e o desvio padrão. O escore Z indica o quanto o valor medido se desvia da média de referência, determinando a reserva ovariana reduzida (<-1,7 escore Z). Com este método, as densidades foliculares podem ser usadas como uma medida valiosa da reserva ovariana para pacientes jovens que necessitam de preservação da fertilidade.

Introdução

O ovário é um órgão dinâmico e endocrinologicamente ativo, consistindo de um córtex externo e uma medula interna. Heterogeneamente distribuídos dentro dos ovários estão os folículos, que contêm o oócito gonadal circundado por células estromais da granulosa¹. Todos os folículos já são formados durante o desenvolvimento fetal, atingindo o pico por volta das 20 semanas de idade gestacional, seguido por um declínio exponencial. Ao nascer, 1-2 milhões de folículos primordiais permanecem dentro do córtex e apenas algumas centenas de milhares de folículos sobrevivem até a puberdade². O pool de ....

Protocolo

Todos os procedimentos realizados foram aprovados pela Autoridade Sueca de Revisão Ética (pacientes com Sveafertil, Dnr: 2019-03802) e pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário de Helsinque (pacientes com HCH, Dnr 340/13/03/03/2015). Informações escritas e orais sobre o estudo foram fornecidas pelas enfermeiras pesquisadoras, e o consentimento informado foi obtido de acordo com a Declaração de Helsinque. Para os pacientes menores de 18 anos, o consentimento informado foi obtido dos responsáveis legais. Todas as amostras foram pseudonimizadas e processadas de acordo com o Regulamento Geral de Proteção de Dados (GDPR) europeu. Os d....

Discussão

As mulheres nascem com um pool finito de oócitos, que não pode ser reabastecido. A reserva ovariana é um determinante chave do potencial reprodutivo de uma mulher. Este artigo descreve um método para a quantificação histológica da densidade folicular e sua comparação com padrões de referência usando escores Z de densidades de folículos corticais ovarianos em pacientes jovens e mulheres de até 25 anos de idade.

Neste protocolo, o tecido ovariano é.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher	14190144
1x Phosphate Buffered Saline w/ CaCl2, MgCl2, 1 g/L D-glucose, 36 mg/L pyruvate	Thermo Fisher	14287-080
37% Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	1.09057.1000
70% ethanol	Histolabs	01370.01L
95% ethanol	Fisher scientific	10572143
Absolute ethanol	Histolabs	01399.01L
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132-1L
Eosin Y Free acid	Sigma-Aldrich	E4009-5G
Formaldehyde	Thermo Fisher	28908
Haematoxylin solution according to Delafield	Sigma-Aldrich	03971-250ML
ImageJ
Microsoft Excel
Microtome
Pertex mounting solution	Histolabs	00840-05
Propofol	Baxter Holding B.V.	N01AX10	ATC-code provided instead of catalog number
QuPath			https://qupath.github.io/
Rocuronium bromide	B. Braun Melsungen AG	M03AC09	ATC-code provided instead of catalog number
Scott's tap water substitute concentrate	Sigma-Aldrich	S5134-6x100ml
Sevoflurane	Baxter Medical AB	N01AB08	ATC-code provided instead of catalog number
Slide scanner
Sufentanil	Hameln Pharma gmbh	N01AH03	ATC-code provided instead of catalog number
Sugammadex	Baxter Holding B.V.	V03AB35	ATC-code provided instead of catalog number
SuperFrost plus white	Histolabs	06400
SuperFrost Plus White microscope slides	Histolabs	06400
Xylene	Saveen Werner	131769.1611