大鼠胫骨糖尿病和骨质疏松症模型的外科骨植入技术

摘要

在大鼠模型中放置植入物是临床研究的重要实验程序。本研究提出了一种将钛植入物植入糖尿病和骨质疏松症大鼠模型的胫骨的综合手术方案。

摘要

长期以来，大鼠一直是种植牙和骨科中有价值的动物模型，特别是在研究生物材料和骨组织之间的相互作用方面。大鼠的胫骨经常被选择，因为它很容易通过薄组织层（皮肤和肌肉）进行手术进入，并且其内侧面部的形状平坦，便于手术插入骨内装置。此外，该模型能够诱导特定疾病，模拟各种临床条件，以评估对不同植入物条件（如几何形状、表面纹理或生物线索）的生物反应。然而，尽管具有坚固的皮质结构，但某些骨内装置可能需要调整设计和尺寸才能成功植入。因此，建立标准化的手术方法来操作植入区域的软组织和硬组织对于确保正确放置种植体或螺钉装置至关重要，尤其是在种植牙和骨科等领域。这项研究包括 80 只 Sprague Dawley 大鼠，根据它们各自的疾病分为两组:第 1 组骨质疏松症和第 2 组 2 型糖尿病。在 4 周和 12 周时进行植入，由同一位外科医生遵循一致的手术技术。观察到积极的生物学反应，表明放置的所有植入物都完全骨结合。这些结果验证了手术方案的成功，该方案可以复制到其他研究中，并作为生物材料界的基准。值得注意的是，两种疾病模型的骨整合值在 4 周和 12 周都保持稳定，表明植入物随着时间的推移而持久整合，并强调早在 4 周就建立亲密骨连接。

引言

通常选择大鼠作为实验对象是因为与大型动物模型相比，它们易于繁殖且相对便宜。新程序的出现，例如骨质疏松症或糖尿病等疾病的可靠繁殖，使该模型特别适用于分析治疗的潜在用途和/或疾病对药物和手术装置或程序的生物反应的影响 ^1,2。

大鼠的骨量增加主要发生在出生后的前 6 个月，尽管一些研究人员认为，长骨至少会持续生长一年，并且长度会逐渐增加¹。随着年龄的增长，会出现从建模到重塑的过渡，这并不是在所有情况下都平等地发生在整个骨骼^{中 2}。雌性 Sprague Dawley 大鼠的生长速度比雄性大鼠慢，体重达到的峰值比雄性大鼠低¹。大鼠的持续骨伸长和不同的骨重塑动力学是解决人类健康问题时必须考虑的因素;然而，目前还没有找到任何实验研究表明大鼠骨骼终生发育或该物种无法重塑骨骼¹。 如果实验在 10 个月大左右开始，由于这种纵向骨骼生长，距离胫骨生长板至少 1 毫米的边缘应保持完整，这是种植牙研究中要考虑的问题²。激素也是骨骼研究的一个关键参数，因为在 8 个月大时，发现雄性大鼠的^胫骨骨宽比雌性高 22%，断裂强度高 33%。

因此，疾病的可靠复制在骨科和种植牙中非常重要，因为骨科螺钉或牙科植入物的骨结合是一个复杂的过程，取决于影响对装置植入骨骼的全身反应的许多因素。众所周知，骨质疏松症和糖尿病等全身性疾病会影响骨科和种植牙的成功率，因此可以在大鼠模型中可靠地复制这些疾病，以探索克服这些限制的方法。

大鼠胫骨由于易于手术进入、骨量适中和内侧板上的扁平形状，使其适合外科骨植入实验 ^4,5，并已用于许多研究探索种植体表面对骨整合的影响 ^4,5,6.越来越多的研究评估了添加到植入物表面的涂层和物质对健康动物⁷ 和受糖尿病或骨质疏松症影响的受损动物 8,9,10,11,12,13,14 的骨结合的影响。

放置在一只大鼠胫骨中的植入装置的数量是有限的，并且可能因研究类型而异。根据植入物的数量或研究条件，必须调整设备的尺寸以尽量减少手术创伤。在对一个植入物的研究中，可以放置一个接近人类大小的植入物（直径 2.0 毫米，长度 4 至 5 毫米），并且可以实现双皮层锚固 6,7,15,16。多种植体方案中的种植体尺寸应采用合适的种植体尺寸（直径 1.5 毫米，长度 2.5 毫米）^4,17。

本研究旨在描述两种大鼠模型:骨质疏松症和糖尿病大鼠模型在胫骨上放置钛植入物的标准化手术方案。此外，本研究允许测试手术方案以评估不同类型的植入物表面生物功能化及其对骨结合的影响。

将 80 只大鼠的样本分为两组。在第 1 组中，选择了 40 只切除卵巢的 Sprague Dawley 雌性和 5 只假动物，平均体重为 484 克，平均年龄为 12 周。根据供应商的建议（见 材料表），绝育三个月后，实验开始。这个等待期确保了性激素的消失。手术时根据显微计算机断层扫描 （micro-CT） 骨分析确认骨质疏松症，与假手术组相比，骨质流失平均为 20%。第 2 组由 40 只患有 II 型糖尿病的 BBDR （生物育种糖尿病抗性） 转基因 Sprague Dawley 大鼠组成。平均体重为 730 克，平均年龄为 12 周。手术前，连续 3 天的血糖测量结果高于 200 mg/dL 证实糖尿病状态。空腹 6 h 用血糖仪测量血糖，尾部穿刺收集血滴。

使用了长度为 2 mm、直径为 1.8 mm 的 3 级钛植入物。所有植入物均在洁净室条件下进行消毒，使用超声浴（230 VAC，50/60 Hz，360 W）在环己烷（3 次，每次 2 分钟）、丙酮（一次，每次 1 分钟）、去离子水（3 次，每次 2 分钟）、乙醇（3 次，每次 2 分钟）中进行超声清洁。然后，用氮气干燥样品，并将 0.5 bar 的氮气束直接施加到样品上。植入前，先将植入物浸泡在去离子水中，然后浸入 70% 乙醇 （v/v） 中 10 分钟。在此之后，将植入物转移到无菌微量离心管中，并在无菌条件下保存直至手术。

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研究方案

所有实验程序均按照西班牙法律（第 53/2013 号皇家法令）和加泰罗尼亚政府法规（第 214/97 号法令）实施的欧洲共同体保护科学用途动物指南（指令 2010/63/EU）进行。所有动物程序和处理的伦理批准均已获得 Vall D'Hebron Institut de Recerca 动物实验伦理委员会（注册号 72/18 CEEA）的批准。对于骨质疏松模型，使用平均体重为 484 g、平均年龄为 12 周的雌性 Sprague Dawley 大鼠。至于糖尿病模型，采用了平均体重为 730 克、平均年龄为 12 周的转基因雌性雌性 BBDR（生物育种糖尿病抵抗力）大鼠。所有动物均来自商业供应商。 材料表中列出了研究中使用的动物、试剂和设备的具体细节。

1. 动物的麻醉/药理和准备

1. 在手术开始前 10-15 分钟通过皮下注射使用 0.05 mg/kg 的丁丙诺啡和 2 mg/kg 的美洛昔康进行术前镇痛。
2. 使用吸入异氟醚进行术中麻醉:诱导期间以 5% 的新鲜空气开始，并保持在 3%。在大鼠室中诱导麻醉，并在手术过程中以锥形鼻适应维持异氟醚供应。

2. 手术准备

1. 使用直肠探针测量麻醉动物的体温，并在整个手术过程中使用电子控制加热垫提供热支持。手术开始前必须涂抹眼膏，以避免角膜干燥。
   注意:如有必要，必须在检查眼睛干涩后重新涂抹软膏。
2. 用电动剃须刀修剪头发并涂抹脱毛霜以去除任何残留的皮毛。
3. 通过使用无菌拭子以碘和 70% （v/v） 乙醇的方式清洁膝关节皮肤，从切口线内部开始并向外移动，无需重新追踪，从而获得无菌手术区域。至少连续进行三次清洁轮换（碘-乙醇-碘）。
4. 通过在动物上放置无菌开孔手术布，通过中央开口露出腿部来隔离手术区域（图 1）。

3. 手术

1. 手术暴露
   1. 沿胫骨前内侧面的近端边界，在干骺端区域垂直做一个约 1 厘米长的全层皮肤切口，以暴露骨骼（图2）。
   2. 在切开时稳定腿部并将皮肤拉紧在下面的骨骼上，确保干净的切口保持在正确的位置。通过使用浸泡在盐水溶液中的敷料清洁预期的轻微出血来管理（图 2）。
      注意:大鼠皮肤薄而下垂或松弛。稳定皮肤是至关重要且必要的。
   3. 使用小型骨膜电梯将组织从骨骼上完全分离（图3）。
   4. 暴露骨骼，直到识别出 胫骨颅肌、 股薄 肌和 腓肠肌外侧头肌在胫骨内侧后缘的插入处，因为纤维状白色组织牢固地粘附在骨骼上（图3）。
      注意:重要的是要识别这组肌肉插入物，以便将植入物放置在整个样本中具有相似特征和刺激的骨骼区域，无论大鼠的大小如何。
2. 钻孔工艺
   1. 在胫骨近端嵴和胫骨内侧面后边界之间的正确区域开始钻孔过程，与 胫骨颅肌、 股薄肌 和 腓肠肌外侧头肌的插入点相邻，避免任何肌肉损伤。
      注意:正确的位置应该是距胫骨平台5 mm ± 2 mm。
   2. 在接近 20 °C 的盐溶液灌溉下，使用具有 20:1 还原反角的手术电动机，以最大 150 rpm（转/分钟）的速度钻孔。
      注意:只需要两次练习。
   3. 从盐溶液灌溉下 4 毫米深度的喷枪导向钻（图 2.4）开始。
      注意:每个钻头最多使用 10 次。
   4. 作为第二个钻头，在盐溶液下使用（图 4）深度为 2.4 mm、直径为 1.6 mm 的麻花设计钻头。
      注意:每个钻头最多使用 10 次。
3. 种植体植入
   1. 插入植入物，将中间件（图 5）连接到 20:1 复位对角。
   2. 在放置植入物之前，通过在同时盐水冲洗 10 秒的情况下以反角旋转植入物，清洁植入物上的任何残留化学消毒剂（图 5）。
   3. 使用中间件以 20 rpm 的速度放置钛植入物（纵向 2 mm，直径 1.8 mm），同时监测实时扭矩值，记录最大插入扭矩。
      注意:由于最终钻头和植入物之间的差异以及植入物的圆柱形轮廓，预计插入植入物的初始难度会很大;然而，一旦植入物穿透初始皮质骨，这种初始困难就会很快恢复正常。
   4. 在植入物完全穿过插入的皮质骨（即胫骨的平坦内侧）之前完成植入物植入。
      注意:在植入物插入的最后时刻，重要的是将植入物略微留在皮质骨外或与插入的皮质骨齐平，即胫骨的平坦内侧，以确保初级稳定性（图6）。
4. 伤口闭合
   1. 使用 4/0 单丝合成可吸收缝合线（糖苷酸盐）用简单的内部缝合线缝合肌肉组织边界（图7）。
   2. 使用 4/0 单丝合成可吸收缝合线（糖苷酸盐）通过皮内缝合线进行皮肤闭合（图 7）。

4. 显微 CT 扫描

1. 完成手术后，仍处于全身麻醉状态，进行显微 CT 扫描以确认植入物放置正确。
2. 将大鼠从手术床上取出，放在扫描床上。使用 micro-CT 实时扫描模式定位手术腿，并将视野置于植入物的中心。
   注:推荐的采集参数为 5 mm 的视场、0.0001 mm³、50 kV、200 μA 的空间分辨率和 3 min 的采集时间。
3. 获得扫描后，根据步骤 5.2.1 确认植入物的近端与胫骨平台表面之间的正确距离。
   注意:该值将有助于技术的标准化（图 8）。

5. 术后护理

1. 成像采集后，将大鼠放回笼子并监测直至完全恢复。
   注意:这大约需要 5-10 分钟，具体取决于动物模型。由于与糖尿病相关的代谢变化，预计糖尿病大鼠的麻醉状态会更长，恢复时间也会更长。
2. 每 6-8 小时施用丁丙诺啡 （0.1 mg/kg），每 24 小时施用美洛昔康 （5 mg/kg），皮下注射，长达 72 小时。
3. 拆线时间
   1. 每天检查手术伤口是否有感染、缝合完整性或其他问题，并在手术后 15 天去除缝合残留物（如有必要）。

6. 安乐死

1. 根据美国国立卫生研究院 （NIH） 指南，使用 CO₂ 室对动物实施安乐死，植入时间（4 周或 4 周）后 CO₂ 填充率为腔室体积的 30%-70%/分钟。

7. 术后分析

1. 对于这两种模型（骨质疏松症和糖尿病），安乐死后通过离断去除胫骨以进行进一步分析。
   注意:关于显微 CT 分析，数据允许计算骨植入物接触 （BIC）。使用先前描述的参数进行 CT 采集，并通过将骨面积 （mm²） 除以皮质区域计算的植入物面积 （mm²） 来进行 BIC 分析，采用文献¹⁸ 中已经描述的方案。显示了每个模型的代表性图像，骨质疏松症（图 9）和糖尿病（图 10）。

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结果

手术阶段
值得一提的是，由于诱发的疾病，本研究中使用的两种动物模型都存在一定的限制。这些关于硬组织和软组织操作的限制在外科手术过程中得到反映。

在糖尿病模型中，大鼠更大，因此在外科手术过程中难以稳定腿部。这增加了手术时间，从而增加了麻醉时间，这需要更长的恢复时间，因此在术后需要更加警惕。

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讨论

尽管大鼠是研究骨结合的广泛使用的模型，但定义和描述一种可重复的手术技术以充分放置植入物非常重要。这种技术可以作为科学界的指南。此外，某些疾病（如骨质疏松症和糖尿病）会改变骨骼代谢，这一事实意味着对正确设计外科手术的更强烈需求。与其他动物模型相比，大鼠具有优势，因为它表现出骨质疏松症（自发性和低影响性骨折）和糖尿病以及饮食诱导的...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G needles+A2:C30	Terumo	NN-2238R
4/0 monofilament synthetic resorbable suture	Braun ( MonoSyn)
5 mL, 10 mL syringes	Braun	4617100V-02 4606051V
Adson forceps	Antão Medical	Ref: A586
BBDR ( Biobreeding Diabetes Resistant ) Sprague Dawley Rats	Janvier Labs
Betadine	Mylan
Buprecare	Animalcare (UK)
Castroviejo Caliper 0-40 mm 15 cm angled	UL AMIN Industries
Castroviejo Needle Holder	Antão Medical	Ref: AM1702
Dental surgery scissors curved and straight	Antão Medical	AMA603 / AMA600
Electric shaver	Oster Pro 3000i	34264482227
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T	Ref: 11150-10
Gauze pads	COVIDIEN	441001
Glucometer	Menarini (Italy)
Helicoidal Drill / OSTEO-PIN DRILL Ø1.6 mm	soadco	Ref. OS-8001
Implants / SCREW OSTEO-PIN Ø1.8 x 2.0 mm	soadco	Ref. OS-3
Isoflo	Le Vet Pharma (Netherlands)
Lance pilot drill / Lanceolate Drill (DS)	soadco	Ref. 10 02 01 T
Latex gloves - Surgical gloves sterile	Hartmann	Ref: 9426495
Lucas Surgical Curette	Antão Medical	Ref: AMA940-3
Metacam	Boehringer Ingelheim(Germany)
Micro forceps straight	nopa	Ref: AB 542/12
Micro-CT scan( Quantum Fx microCT )	Perkin Elmer (US)
Osteoporotic Sprague Dawley females Rats	Janvier Labs
Periosteal elevator -  Molt 2-4	Antão Medical	Ref: A1564
Physiologic solution for Irrigation	Hygitech	Ref:10238
Scalpel Blade Carbon Steel 15C	Razor Med	Ref: 02846
Sterile Gauze Swabs	Alledental	Ref: 270712
Sterile Irrigation system	Hygitech	Ref:HY1-110001D
Sterile towels (1 piece per animal)	Dinarex	4410
Surgical contra-angle handpiece	W&H	Ref: WS-75 LED G
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 08877
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 01309
Surgical Electric Motor	WH Implantmed Type: SI-1023	Ref: 30288000
Surgical scalpel handle	AsaDental	Ref: 0350-3
Towel clamps	Xelpov surgical	AF-773-11
Ultrasonic device	J.P. Selecta, Abrera, Spain