Методика хирургической имплантации костной ткани на моделях сахарного диабета и остеопороза большеберцовой кости крыс

Резюме

Установка имплантатов в модель крысы является важной экспериментальной процедурой для клинических исследований. В этом исследовании представлен комплексный хирургический протокол имплантации титановых имплантатов в большеберцовую кость моделей крыс с диабетом и остеопорозом.

Аннотация

Крыса долгое время служила ценным животным образцом в имплантологии и ортопедии, особенно в изучении взаимодействия между биоматериалами и костной тканью. Большеберцовую кость крысы часто выбирают из-за ее легкого хирургического доступа через тонкие слои тканей (кожи и мышц) и уплощенной формы медиальной поверхности, облегчающей хирургическое введение внутрикостных устройств. Кроме того, эта модель позволяет вызывать определенные заболевания, имитируя различные клинические условия, для оценки биологических реакций на различные условия имплантата, такие как геометрия, текстура поверхности или биологические сигналы. Однако, несмотря на прочную кортикальную структуру, некоторые внутрикостные устройства могут потребовать адаптации конструкции и размера для успешной имплантации. Таким образом, создание стандартизированных хирургических методов для манипулирования как мягкими, так и твердыми тканями в области имплантации имеет важное значение для обеспечения правильной установки имплантата или винтового устройства, особенно в таких областях, как имплантология и ортопедия. В этом исследовании приняли участие восемьдесят крыс Sprague Dawley, разделенных на две группы в зависимости от их соответствующих заболеваний: группа 1 с остеопорозом и группа 2 с диабетом 2 типа. Имплантация проводилась через 4 недели и 12 недель, с одним и тем же хирургом, который следовал последовательной хирургической технике. Наблюдался положительный биологический ответ, свидетельствующий о полной остеоинтеграции всех установленных имплантатов. Эти результаты подтверждают успех хирургического протокола, который может быть воспроизведен для других исследований и служить ориентиром для сообщества биоматериалов. Примечательно, что значения остеоинтеграции оставались стабильными как на 4-й, так и на 12-й неделях для обеих моделей заболевания, демонстрируя прочную интеграцию имплантата с течением времени и подчеркивая установление тесного костного соединения уже через 4 недели.

Введение

Общий выбор крыс в качестве подопытных обусловлен тем, что их легко разводить и они относительно недороги по сравнению с более крупными животными моделями. Появление новых процедур, таких как надежное воспроизведение расстройства, например, остеопороза или диабета, делает эту модель особенно полезной для анализа потенциального использования методов лечения и/или влияния заболевания на биологическую реакцию на лекарства и хирургические устройства^{или процедуры.}

Набор костной массы у крысы происходит в основном в течение первых 6 месяцев жизни, хотя некоторые исследователи считают, что длинная кость постоянно растет в течение как минимум года с постепенным^{увеличением длины.} С возрастом происходит переход от моделирования к ремоделированию, который происходит не во всех случаях одинаково по всем^{костям2}. Самки крыс Sprague Dawley растут медленнее, чем самцы крыс, и достигают более низкого пика веса, чем самцы крыс¹. Непрерывное удлинение кости и разнообразная динамика ремоделирования кости у крыс являются факторами, которые необходимо учитывать при решении проблем со здоровьем человека; Тем не менее, до сих пор не удалось найти ни одного экспериментального исследования, которое показало бы либо пожизненное развитие костей крыс, либо неспособность вида к ремоделированию^костей. Если эксперименты начинаются в возрасте около 10 месяцев, то из-за этого продольного роста кости следует оставить нетронутым отступ не менее 1 мм от ростовой пластинки большеберцовой кости, что следует учитывать^{при исследованиях} зубных имплантатов. Гормоны также являются ключевым параметром в исследованиях костей, поскольку в возрасте 8 месяцев было обнаружено, что самцы крыс имеют на 22% большую ширину кости и на 33% большую прочность на разрыв, чем самки в большеберцовой кости³.

Таким образом, надежное воспроизведение заболевания очень важно в ортопедии и имплантологии, поскольку остеоинтеграция ортопедического винта или зубного имплантата является сложным процессом, который зависит от множества факторов, влияющих на системную реакцию на имплантацию устройства в кость. Известно, что системные заболевания, такие как остеопороз и диабет, влияют на успешность в ортопедии и имплантологии, поэтому надежное воспроизведение этих заболеваний на крысах может быть применено для изучения способов преодоления этих ограничений.

Большеберцовая кость крысы, благодаря легкому хирургическому доступу, умеренному объему кости и плоской форме медиальной пластины, делает ее пригодной для хирургических экспериментов по имплантации кости ^4,5, и она использовалась в многочисленных исследованиях, изучающих влияние поверхности имплантата на остеоинтеграцию ^4,5,6. Все большее число исследований оценивают влияние на остеоинтеграцию покрытий и веществ, добавляемых на поверхность имплантата, как у здоровых животных⁷, так и у животных с ослабленным здоровьем, страдающих диабетом или остеопорозом 8,9,10,11,12,13,14.

Количество имплантационных устройств, размещаемых в большеберцовой кости одной крысы, ограничено и может отличаться в зависимости от типа исследования. В зависимости от количества имплантатов или условий исследования, размеры устройств должны быть адаптированы таким образом, чтобы свести к минимуму хирургическую травматичность. В исследованиях с одним имплантатом может быть установлен имплантат размером почти с человека (2,0 мм в диаметре и от 4 до 5 мм в длину), а бикортикальная фиксация может^{быть достигнута} 6,7,15,16. Размеры имплантатов в протоколах с несколькими имплантатами должны соответствовать размеру имплантата (1,5 мм в диаметре и 2,5 мм в длину)^4,17.

Целью настоящего исследования является описание стандартизированного хирургического протокола установки титанового имплантата на большеберцовую кость двух моделей крыс: модели остеопороза и модели крысы с диабетом. Кроме того, данное исследование позволяет апробировать хирургический протокол для оценки различных типов биофункционализации поверхности имплантата и ее влияния на остеоинтеграцию.

Выборка из 80 крыс была разделена на две группы. В 1-ю группу были отобраны 40 овариэктомированных самок Sprague Dawley и 5 фиктивных животных со средним весом 484 г и средним возрастом 12 недель. Основываясь на рекомендациях поставщиков (см. Таблицу материалов), через три месяца после стерилизации эксперимент начался. Этот период ожидания обеспечил исчезновение половых гормонов. Остеопороз был подтвержден во время операции на основании анализа костей с помощью микрокомпьютерной томографии (микрокомпьютерной томографии), который показал потерю костной массы в среднем на 20% по сравнению с фиктивной группой. Группа 2 состояла из 40 генетически модифицированных крыс породы Sprague Dawley с сахарным диабетом II типа BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant). Средний вес составил 730 г, а средний возраст — 12 недель. Перед операцией диабетический статус был подтвержден тремя последовательными днями измерений уровня глюкозы с результатами выше 200 мг/дл. Глюкозу измеряли глюкометром через 6 ч натощак, а каплю крови собирали путем прокола хвоста.

Использовались титановые имплантаты Grade 3 размером 2 мм в длину и 1,8 мм в диаметре. Все имплантаты были стерилизованы в чистых помещениях путем ультразвуковой очистки в циклогексане (3 раза в течение 2 минут), ацетоне (один раз в течение 1 минуты), деионизированной воде (3 раза в течение 2 минут), этаноле (3 раза в течение 2 минут) и ацетоне (3 раза в течение 2 минут) с использованием ультразвуковой ванны (230 В переменного тока, 50/60 Гц, 360 Вт). Затем образцы высушивали газообразным азотом, и азотный пучок при давлении 0,5 бар подавался непосредственно на образцы. Перед имплантацией имплантаты сначала замачивали в деионизированной воде, а затем погружали в 70% этанол (v/v) на 10 минут. После этого имплантаты были перенесены в стерильные микроцентрифужные пробирки и содержались в стерильных условиях до операции.

протокол

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с Руководящими принципами Европейского сообщества по защите животных, используемых в научных целях (Директива 2010/63/ЕС), как это предусмотрено испанским законодательством (Королевский указ 53/2013) и правилами Женералитата Каталонии (Указ 214/97). Этическое одобрение для всех процедур и обращения с животными было получено от Комитета по этике экспериментов на животных Института исследований Валь д'Хеврон (регистрационный номер 72/18 CEEA). Для остеопоротической модели были использованы самки крыс Sprague Dawley со средним весом 484 г и средним возрастом 12 недель. Что касается диабетической модели, то были использованы генетически модифицированные самки крыс BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) со средним весом 730 г и средним возрастом 12 недель. Все животные были получены от коммерческого поставщика. Конкретные сведения о животных, реагентах и оборудовании, использованных в исследовании, приведены в Таблице материалов.

1. Анестезиология/фармакология и подготовка животных

1. За 10-15 мин до начала хирургического вмешательства проводят предоперационное обезболивание бупренорфином в дозе 0,05 мг/кг и мелоксикамом в дозе 2 мг/кг.
2. Проводят внутриоперационную анестезию ингаляционным изофлураном: начинают при 5% на свежем воздухе во время индукции и поддерживают на уровне 3%. Вызывайте анестезию в камере крыс и поддерживайте запас изофлурана с конической адаптацией носа во время операции.

2. Подготовка к операции

1. Измерьте температуру тела животного, находящегося под наркозом, с помощью ректального зонда и используйте грелку с электронным управлением для тепловой поддержки на протяжении всей хирургической процедуры. Глазная мазь должна быть нанесена до начала операции, чтобы избежать сухости роговицы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости мазь необходимо нанести повторно после проверки сухости глаз.
2. Подстригите волосы с помощью электробритвы и нанесите крем для удаления волос, чтобы удалить остатки шерсти.
3. Получите асептическое хирургическое поле путем очистки кожи колена йодом и 70% (v/v) этанола с помощью стерильных тампонов, начиная изнутри и продвигаясь наружу по линии разреза без повторной коррекции. Выполните не менее трех последовательных оборотов очистки (йод-этанол-йод).
4. Изолируйте операционное поле, поместив над животным стерильную фенестрированную хирургическую простыню, обнажая ногу через центральное отверстие (рис. 1).

3. Хирургия

1. Хирургическое воздействие
   1. Сделайте разрез кожи на всю толщину примерно 1 см в длину по вертикали вдоль проксимальной границы переднемедиальной поверхности большеберцовой кости, в области метафиза, чтобы обнажить кость (рис. 2).
   2. Стабилизируйте ногу и натяните кожу к нижележащей кости во время разреза, делая разрез, следя за тем, чтобы чистый разрез оставался в правильном месте. Справьтесь с этим, устранив ожидаемое легкое кровотечение с помощью компресса, смоченного в физрастворе (Рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кожа крысы тонкая и дряблая или дряблая. Стабилизация кожи имеет решающее значение и необходима.
   3. Полностью отделите ткань от кости с помощью небольших надкостничных элеваторов (Рисунок 3).
   4. Обнажайте кость до тех пор, пока не будет выявлено прикрепление черепной мышцы большеберцовой кости, грацилиса и икроножной мышцы головы в задней границе медиальной части большеберцовой кости в виде волокнистой белой ткани, прочно прилегающей к кости (рисунок 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно идентифицировать эту группу мышечных вставок, чтобы имплантат можно было разместить в костной области с одинаковыми характеристиками и стимулами по всему образцу, независимо от размера крысы.
2. Процесс бурения
   1. Начните процесс сверления в правильной области между проксимальным гребнем большеберцовой кости и задней границей медиальной поверхности большеберцовой кости, рядом с прикреплением черепной мышцы большеберцовой кости, грацилиса и латеральной мышцы головы икроножной мышцы, избегая травмирования мышц.1
      ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное расположение должно быть на расстоянии 5 мм ± 2 мм от плато большеберцовой кости.
   2. Сверло с максимальной скоростью 150 об/мин (оборотов/мин) при орошении солевым раствором при температуре близкой к 20 °C с хирургическим электродвигателем с углом редукции 20:1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Потребовалось всего два упражнения.
   3. Начните с пилотной буровой установки (Рисунок 4) на глубине 2,4 мм под орошением солевым раствором.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая дрель имела максимум 10 использований.
   4. В качестве второго сверла используйте (Рисунок 4) спиральное сверло глубиной 2,4 мм и диаметром 1,6 мм под солевым раствором.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая дрель имела максимум 10 использований.
3. Установка имплантатов
   1. Вставьте имплантат с промежуточным элементом (Рисунок 5), прикрепленным к угловому уменьшению 20:1.
   2. Перед установкой имплантата очистите имплантат от остатков химического стерилизатора, повернув его в противоположном углу с одновременным орошением солевым раствором в течение 10 с (рис. 5).
   3. Установите титановый имплантат (2 мм в длину и 1,8 мм в диаметре) с помощью промежуточного элемента со скоростью 20 об/мин, контролируя значение крутящего момента в режиме реального времени, регистрируя максимальный момент введения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначальные трудности при установке имплантата ожидаются из-за разницы между конечным сверлом и имплантатом, а также цилиндрического профиля имплантата; Однако эта начальная сложность быстро нормализуется, как только имплантат проникает в начальную кортикальную кость.
   4. Завершайте установку имплантата до того, как он полностью пройдет через кортикальную кость, где он вставлен, то есть плоскую медиальную поверхность большеберцовой кости.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В последний момент установки имплантата важно оставить имплантат немного за пределами кортикальной кости или на уровне кортикальной кости, где он вставлен, то есть плоской медиальной поверхности большеберцовой кости, чтобы обеспечить первичную стабильность (Рисунок 6).
4. Закрытие раны
   1. Сшивайте границы мышечной ткани простыми внутренними швами с помощью монофиламентного синтетического резорбируемого шовного материала 4/0 (гликонат) (Рисунок 7).
   2. Выполните закрытие кожи с помощью внутрикожного шва с использованием монофиламентного синтетического резорбируемого шовного материала 4/0 (гликонат) (Рисунок 7).

4. Микрокомпьютерная томография

1. После завершения операции и все еще под общим наркозом проведите микрокомпьютерную томографию, чтобы подтвердить правильную установку имплантата.
2. Снимите крысу с операционного ложа и положите ее на сканирующее станище. Определите местоположение прооперированной ноги с помощью режима сканирования микрокомпьютерной томографии в реальном времени и центрируйте поле зрения на имплантате.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые параметры сбора данных: поле зрения 5 мм, пространственное разрешение 0,0001 мм³, 50 кВ, 200 мкА и время сбора данных 3 мин.
3. После того, как сканирование будет получено, подтвердите правильное расстояние между проксимальной стороной имплантата и поверхностью плато большеберцовой кости в соответствии с шагом 5.2.1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это значение будет полезно для стандартизации методики (Рисунок 8).

5. Послеоперационный уход

1. После получения изображения верните крысу в клетку и наблюдайте за ней до полного выздоровления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это занимает примерно 5-10 минут, в зависимости от модели животного. Ожидается, что крысы с диабетом будут дольше оставаться под наркозом и иметь более длительное время восстановления из-за метаболических изменений, связанных с диабетом.
2. Применяют бупренорфин (0,1 мг/кг) каждые 6-8 ч и мелоксикам (5 мг/кг) каждые 24 ч, подкожно, до 72 ч.
3. Время снятия швов
   1. Ежедневно осматривайте операционную рану на предмет инфекции, целостности швов или других проблем, и при необходимости удалите остатки швов через 15 дней после операции.

6. Эвтаназия

1. Усыпляйте животных с использованием камеры CO₂ в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения (NIH) с частотой заполнения CO₂ 30%-70% от объема камеры / мин после времени имплантации (4 недели или 12 недель).

7. Послеоперационный анализ

1. При обеих моделях (остеопороз и диабет) после эвтаназии удаляют большеберцовую кость путем вычленения для дальнейшего анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Что касается анализа микро-КТ, данные позволили рассчитать контакт кости с имплантатом (BIC). Сбор данных КТ проводили с использованием ранее описанных параметров, а анализ БИК проводили путем деления площади кости (^мм2) на площадь имплантата (^мм2), рассчитанную в кортикальной области, с адаптацией протокола, уже описанного в литературе¹⁸. Репрезентативные изображения показаны для каждой модели: остеопороза (рисунок 9) и диабета (рисунок 10).

Результаты

Хирургическая фаза
Важно отметить, что обе животные модели, использованные в этом исследовании, имеют определенные ограничения из-за индуцированных заболеваний. Эти ограничения, связанные с манипуляциями с твердыми и мягкими тканями, отражаются во время х...

Обсуждение

Несмотря на то, что крыса является широко используемой моделью для изучения остеоинтеграции, важно определить и описать воспроизводимую хирургическую технику для адекватной установки имплантатов. Такая методика могла бы послужить руководством для научного сообщес...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G needles+A2:C30	Terumo	NN-2238R
4/0 monofilament synthetic resorbable suture	Braun ( MonoSyn)
5 mL, 10 mL syringes	Braun	4617100V-02 4606051V
Adson forceps	Antão Medical	Ref: A586
BBDR ( Biobreeding Diabetes Resistant ) Sprague Dawley Rats	Janvier Labs
Betadine	Mylan
Buprecare	Animalcare (UK)
Castroviejo Caliper 0-40 mm 15 cm angled	UL AMIN Industries
Castroviejo Needle Holder	Antão Medical	Ref: AM1702
Dental surgery scissors curved and straight	Antão Medical	AMA603 / AMA600
Electric shaver	Oster Pro 3000i	34264482227
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T	Ref: 11150-10
Gauze pads	COVIDIEN	441001
Glucometer	Menarini (Italy)
Helicoidal Drill / OSTEO-PIN DRILL Ø1.6 mm	soadco	Ref. OS-8001
Implants / SCREW OSTEO-PIN Ø1.8 x 2.0 mm	soadco	Ref. OS-3
Isoflo	Le Vet Pharma (Netherlands)
Lance pilot drill / Lanceolate Drill (DS)	soadco	Ref. 10 02 01 T
Latex gloves - Surgical gloves sterile	Hartmann	Ref: 9426495
Lucas Surgical Curette	Antão Medical	Ref: AMA940-3
Metacam	Boehringer Ingelheim(Germany)
Micro forceps straight	nopa	Ref: AB 542/12
Micro-CT scan( Quantum Fx microCT )	Perkin Elmer (US)
Osteoporotic Sprague Dawley females Rats	Janvier Labs
Periosteal elevator -  Molt 2-4	Antão Medical	Ref: A1564
Physiologic solution for Irrigation	Hygitech	Ref:10238
Scalpel Blade Carbon Steel 15C	Razor Med	Ref: 02846
Sterile Gauze Swabs	Alledental	Ref: 270712
Sterile Irrigation system	Hygitech	Ref:HY1-110001D
Sterile towels (1 piece per animal)	Dinarex	4410
Surgical contra-angle handpiece	W&H	Ref: WS-75 LED G
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 08877
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 01309
Surgical Electric Motor	WH Implantmed Type: SI-1023	Ref: 30288000
Surgical scalpel handle	AsaDental	Ref: 0350-3
Towel clamps	Xelpov surgical	AF-773-11
Ultrasonic device	J.P. Selecta, Abrera, Spain