Tecnica chirurgica di impianto osseo per modelli di diabete e osteoporosi della tibia di ratto

Riepilogo

Il posizionamento di impianti in un modello di ratto è una procedura sperimentale essenziale per la ricerca clinica. Questo studio presenta un protocollo chirurgico completo per l'impianto di impianti in tibia nella tibia di modelli di ratto con diabete e osteoporosi.

Abstract

Il ratto è stato a lungo un prezioso modello animale in implantologia dentale e ortopedia, in particolare nello studio delle interazioni tra biomateriali e tessuto osseo. La tibia del ratto è spesso scelta per il suo facile accesso chirurgico attraverso strati sottili di tessuto (pelle e muscoli) e la forma appiattita della sua faccia mediale, facilitando l'inserimento chirurgico di dispositivi intraossei. Inoltre, questo modello consente l'induzione di malattie specifiche, imitando varie condizioni cliniche per valutare le risposte biologiche a diverse condizioni dell'impianto come la geometria, la struttura superficiale o i segnali biologici. Tuttavia, nonostante la sua robusta struttura corticale, alcuni dispositivi intraossei possono richiedere adattamenti nel design e nelle dimensioni per un impianto di successo. Pertanto, la definizione di metodi chirurgici standardizzati per la manipolazione dei tessuti molli e duri nella regione di impianto è essenziale per garantire il corretto posizionamento dell'impianto o del dispositivo a vite, in particolare in campi come l'implantologia dentale e l'ortopedia. Questo studio ha incluso ottanta ratti Sprague Dawley divisi in due gruppi in base alle rispettive malattie: Gruppo 1 con osteoporosi e Gruppo 2 con diabete di tipo 2. Gli impianti sono stati eseguiti a 4 settimane e 12 settimane, con lo stesso chirurgo che ha seguito una tecnica chirurgica coerente. È stata osservata una risposta biologica positiva, che indica la completa osteointegrazione di tutti gli impianti posizionati. Questi risultati convalidano il successo del protocollo chirurgico, che può essere replicato per altri studi e fungere da punto di riferimento per la comunità dei biomateriali. In particolare, i valori di osteointegrazione sono rimasti stabili sia a 4 settimane che a 12 settimane per entrambi i modelli di malattia, dimostrando un'integrazione duratura dell'impianto nel tempo e sottolineando l'instaurazione di una connessione ossea intima già a 4 settimane.

Introduzione

La scelta comune dei ratti come soggetti sperimentali è dovuta al fatto che sono facili da allevare e relativamente economici rispetto ai modelli animali più grandi. L'emergere di nuove procedure, come la riproduzione affidabile di un disturbo, ad esempio l'osteoporosi o il diabete, rende questo modello particolarmente utile per analizzare il potenziale uso di trattamenti e/o l'influenza della malattia nella risposta biologica a farmaci e dispositivi o procedure chirurgiche ^1,2.

L'aumento di massa ossea del ratto avviene per lo più durante i primi 6 mesi di vita, anche se alcuni ricercatori ritengono che l'osso lungo cresca costantemente per almeno un anno con un progressivo aumento della^lunghezza1. Con l'invecchiamento, c'è una transizione dalla modellazione al rimodellamento, che non si verifica in tutti i casi allo stesso modo in tutte le ossa². Le femmine di ratti Sprague Dawley crescono più lentamente dei ratti maschi e raggiungono un picco di peso inferiore rispetto ai ratti maschi¹. L'allungamento osseo continuo e le varie dinamiche di rimodellamento osseo nei ratti sono fattori che devono essere presi in considerazione quando si affrontano i problemi di salute umana; Tuttavia, non è stato ancora possibile trovare alcuna ricerca sperimentale che dimostri lo sviluppo dell'osso di ratto per tutta la vita o l'incapacità della specie di rimodellare l'osso¹. Se la sperimentazione inizia intorno ai 10 mesi di età, un margine di almeno 1 mm dalla cartilagine di accrescimento della tibia deve essere lasciato intatto a causa di questa crescita ossea longitudinale, un problema da considerare negli studi di implantologia dentale². Gli ormoni sono anche un parametro chiave nella ricerca ossea poiché a 8 mesi di età, è stato riscontrato che i ratti maschi hanno una larghezza ossea maggiore del 22% e una resistenza alla rottura del 33% superiore rispetto alle femmine nella tibia³.

La riproduzione affidabile di una malattia è quindi molto importante in ortopedia e implantologia poiché l'osteointegrazione di una vite ortopedica o di un impianto dentale è un processo complesso che dipende da numerosi fattori che influenzano la risposta sistemica all'impianto del dispositivo nell'osso. È noto che disturbi sistemici come l'osteoporosi e il diabete influenzano il tasso di successo in ortopedia e implantologia, quindi la riproduzione affidabile di tali disturbi in modelli di ratto può essere applicata per esplorare modi per superare queste limitazioni.

La tibia di ratto, grazie al facile accesso chirurgico, al volume osseo moderato e alla forma piatta sulla placca mediale, la rende adatta per esperimenti chirurgici di impianto osseo ^4,5 ed è stata utilizzata in numerosi studi di ricerca che esplorano gli effetti della superficie dell'impianto sull'osteointegrazione ^4,5,6. Un numero crescente di studi valuta gli effetti sull'osteointegrazione dei rivestimenti e delle sostanze aggiunte alla superficie dell'impianto sia in animali sani⁷ che in animali compromessi affetti da diabete o osteoporosi 8,9,10,11,12,13,14.

Il numero di dispositivi impiantabili inseriti nella tibia di un ratto è limitato e può variare a seconda del tipo di studio. A seconda del numero di impianti o delle condizioni di studio, le dimensioni dei dispositivi devono essere adattate per ridurre al minimo il trauma chirurgico. Negli studi con un impianto, è possibile posizionare un impianto di dimensioni quasi umane (2,0 mm di diametro e da 4 a 5 mm di lunghezza) e si può ottenere un ancoraggio bi-corticale 6,7,15,16. Le dimensioni degli impianti nei protocolli multi-implantari devono adottare una dimensione dell'impianto appropriata (1,5 mm di diametro e 2,5 mm di lunghezza)^4,17.

Il presente studio si propone di descrivere un protocollo chirurgico standardizzato per il posizionamento di impianti in titanio sulla tibia di due modelli di ratto: il modello di ratto per l'osteoporosi e il modello di ratto per il diabete. Inoltre, questo studio consente di testare il protocollo chirurgico per valutare diversi tipi di biofunzionalizzazione della superficie implantare e il suo effetto sull'osteointegrazione.

Un campione di 80 ratti è stato diviso in due gruppi. Nel gruppo 1 sono state selezionate 40 femmine di Sprague Dawley ovariectomizzate e 5 animali fittizi, con un peso medio di 484 g e un'età media di 12 settimane. Sulla base delle raccomandazioni dei fornitori (vedi Tabella dei materiali), tre mesi dopo la sterilizzazione, l'esperimento è iniziato. Questo periodo di attesa ha assicurato la scomparsa degli ormoni sessuali. L'osteoporosi è stata confermata al momento dell'intervento chirurgico sulla base dell'analisi ossea con tomografia microcomputerizzata (micro-CT), che ha riflesso una perdita ossea media del 20% rispetto al gruppo fittizio. Il gruppo 2 era composto da 40 ratti BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) geneticamente modificati Sprague Dawley con diabete di tipo II. Il peso medio era di 730 g e l'età media era di 12 settimane. Prima dell'intervento chirurgico, lo stato diabetico è stato confermato con tre giorni consecutivi di misurazioni del glucosio con risultati superiori a 200 mg/dL. Il glucosio è stato misurato con un glucometro in 6 ore di digiuno e una goccia di sangue è stata raccolta mediante puntura della coda.

Sono stati utilizzati impianti in titanio di grado 3 di 2 mm di lunghezza e 1,8 mm di diametro. Tutti gli impianti sono stati sterilizzati in camera bianca, mediante ecografia in cicloesano (3 volte per 2 minuti), acetone (una volta per 1 minuto), acqua deionizzata (3 volte per 2 minuti), etanolo (3 volte per 2 minuti) e acetone (3 volte per 2 minuti) utilizzando un bagno a ultrasuoni (230 V CA, 50/60 Hz, 360 W). Quindi, i campioni sono stati essiccati con azoto gassoso e un fascio di azoto a 0,5 bar è stato applicato direttamente sui campioni. Prima dell'impianto, gli impianti sono stati prima immersi in acqua deionizzata e poi immersi in etanolo al 70% (v/v) per 10 minuti. Successivamente, gli impianti sono stati trasferiti in provette sterili per microcentrifuga e mantenuti in condizioni sterili fino all'intervento chirurgico.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le Linee Guida della Comunità Europea per la protezione degli animali utilizzati a fini scientifici (Direttiva 2010/63/UE) come recepite dalla legge spagnola (Regio Decreto 53/2013) e dai regolamenti della Generalitat de Catalunya (Decreto 214/97). L'approvazione etica per tutte le procedure e la manipolazione degli animali è stata ottenuta dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell'Institut de Recerca Vall D'Hebron (numero di registrazione 72/18 CEEA). Per il modello osteoporotico, sono state utilizzate femmine di ratti Sprague Dawley con un peso medio di 484 g e un'età media di 12 settimane. Per quanto riguarda il modello diabetico, sono state impiegate femmine di ratti BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) geneticamente modificati con un peso medio di 730 g e un'età media di 12 settimane. Tutti gli animali provenivano da un fornitore commerciale. I dettagli specifici degli animali, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Anestesia/farmacologia e preparazione degli animali

1. Somministrare analgesia prechirurgica utilizzando buprenorfina a 0,05 mg/kg e meloxicam a 2 mg/kg attraverso iniezioni sottocutanee 10-15 minuti prima di iniziare la procedura chirurgica.
2. Eseguire l'anestesia intra-chirurgica con isoflurano per via inalatoria: iniziare al 5% all'aria aperta durante l'induzione e mantenere al 3%. Indurre l'anestesia in una camera di ratto e mantenere l'apporto di isoflurano con un adattamento del naso conico durante l'intervento chirurgico.

2. Preparazione per l'intervento chirurgico

1. Misurare la temperatura corporea dell'animale anestetizzato con una sonda rettale e utilizzare un termoforo a controllo elettronico per il supporto termico durante la procedura chirurgica. L'unguento per gli occhi deve essere applicato prima dell'inizio dell'intervento chirurgico per evitare la secchezza corneale.
   NOTA: Se necessario, l'unguento deve essere riapplicato dopo aver controllato la secchezza oculare.
2. Taglia i peli con un rasoio elettrico e applica una crema depilatoria per eliminare il pelo rimasto.
3. Ottenere un campo chirurgico asettico pulendo la pelle del ginocchio in un modello di iodio ed etanolo al 70% (v/v) utilizzando tamponi sterili, partendo dall'interno e spostandosi verso l'esterno della linea di incisione senza ritracciare. Eseguire un minimo di tre cicli di pulizia consecutivi (iodio-etanolo-iodio).
4. Isolare il campo operatorio posizionando un telo chirurgico fenestrato sterile sopra l'animale, esponendo la zampa attraverso l'apertura centrale (Figura 1).

3. Chirurgia

1. Esposizione chirurgica
   1. Praticare un'incisione cutanea a tutto spessore di circa 1 cm di lunghezza verticalmente lungo il bordo prossimale della faccia anteromediale della tibia, nella regione della metafisi per esporre l'osso (Figura 2).
   2. Stabilizzare la gamba e tendere la pelle contro l'osso sottostante mentre si esegue l'incisione, assicurandosi che un'incisione pulita rimanga nella posizione corretta. Gestire pulendo l'emorragia leggera prevista con un impacco imbevuto di soluzione salina (Figura 2).
      NOTA: La pelle del ratto è sottile e cadente o allentata. La stabilizzazione della pelle è fondamentale e necessaria.
   3. Staccare completamente il tessuto dall'osso utilizzando piccoli elevatori periostali (Figura 3).
   4. Esporre l'osso fino all'identificazione dell'inserzione del muscolo tibiale craniale, del gracile e del muscolo laterale della testa del gastrocnemio nel bordo posteriore dell'aspetto mediale della tibia, come un tessuto bianco fibroso saldamente aderente all'osso (Figura 3).
      NOTA: È importante identificare questo gruppo di inserzioni muscolari per consentire il posizionamento dell'impianto in una regione ossea con caratteristiche e stimoli simili in tutto il campione, indipendentemente dalle dimensioni del ratto.
2. Processo di foratura
   1. Iniziare il processo di perforazione nella regione corretta tra la cresta tibiale prossimale e il limite posteriore della faccia mediale dell'osso tibiale, contigua all'inserzione del muscolo tibiale craniale, del gracile e del muscolo laterale della testa del gastrocnemio, evitando qualsiasi lesione muscolare.1
      NOTA: La posizione corretta deve essere a 5 mm ± 2 mm dal piatto tibiale.
   2. Forare con un massimo di 150 giri/min (giri/min) in irrigazione in soluzione salina a una temperatura prossima a 20 °C con un motore elettrico chirurgico con contrangolo di riduzione 20:1.
      NOTA: Sono stati necessari solo due esercizi.
   3. Iniziare con un trapano pilota a lancia (Figura 4) a una profondità di 2,4 mm in irrigazione con soluzione salina.
      NOTA: Ogni trapano ha avuto un massimo di 10 utilizzi.
   4. Come seconda punta, utilizzare (Figura 4) una punta elicoidale a una profondità di 2,4 mm con un diametro di 1,6 mm in soluzione salina.
      NOTA: Ogni trapano ha avuto un massimo di 10 utilizzi.
3. Posizionamento dell'impianto
   1. Inserire l'impianto con un pezzo intermedio (Figura 5) attaccato al contrangolo di riduzione 20:1.
   2. Prima di posizionare l'impianto, pulire l'impianto da eventuali residui di sterilizzante chimico ruotandolo nel contrangolo con irrigazione salina simultanea per 10 s (Figura 5).
   3. Posizionare l'impianto in titanio (2 mm di lunghezza e 1,8 mm di diametro) utilizzando il pezzo intermedio a 20 giri/min monitorando il valore della coppia in tempo reale, registrando la coppia di inserimento massima.
      NOTA: Si prevede una difficoltà iniziale nell'inserimento dell'impianto a causa della differenza tra la fresa finale e l'impianto, nonché del profilo cilindrico dell'impianto; Tuttavia, questa difficoltà iniziale si normalizza rapidamente non appena l'impianto penetra nell'osso corticale iniziale.
   4. Completare l'inserimento dell'impianto prima che passi completamente l'osso corticale in cui è inserito, ovvero la faccia mediale piatta della tibia.
      NOTA: Nel momento finale dell'inserimento dell'impianto, è importante lasciare l'impianto leggermente al di fuori dell'osso corticale o all'altezza dell'osso corticale in cui è inserito, ovvero la faccia mediale piatta della tibia, per garantire la stabilità primaria (Figura 6).
4. Chiusura della ferita
   1. Sutura i bordi del tessuto muscolare con semplici suture interne utilizzando una sutura sintetica riassorbibile monofilamento 4/0 (gliconato) (Figura 7).
   2. Eseguire la chiusura della pelle con una sutura intradermica utilizzando una sutura sintetica riassorbibile in monofilamento 4/0 (gliconato) (Figura 7).

4. Scansione micro-CT

1. Dopo aver completato l'intervento chirurgico e ancora in anestesia generale, eseguire una scansione micro-CT per confermare il corretto posizionamento dell'impianto.
2. Rimuovere il ratto dal lettino operatorio e posizionarlo sul lettino di scansione. Localizzare la gamba operata utilizzando la modalità di scansione dal vivo micro-CT e centrare il campo visivo sull'impianto.
   NOTA: I parametri di acquisizione consigliati sono un campo visivo di 5 mm, una risoluzione spaziale di 0,0001 mm³, 50 kV, 200 μA e un tempo di acquisizione di 3 min.
3. Una volta acquisita la scansione, confermare la corretta distanza tra l'aspetto prossimale dell'impianto e la superficie del piatto tibiale, secondo il passaggio 5.2.1.
   NOTA: Questo valore sarà utile per la standardizzazione della tecnica (Figura 8).

5. Cure postoperatorie

1. Dopo l'acquisizione dell'imaging, riportare il ratto nella sua gabbia e monitorarlo fino al completo recupero.
   NOTA: Questo richiede circa 5-10 minuti, a seconda del modello animale. Ci si aspetta che i ratti diabetici rimangano anestetizzati più a lungo e abbiano un tempo di recupero più lungo a causa dei cambiamenti metabolici associati al diabete.
2. Somministrare buprenorfina (0,1 mg/kg) ogni 6-8 ore e meloxicam (5 mg/kg) ogni 24 ore, per via sottocutanea, fino a 72 ore.
3. Tempo di rimozione della sutura
   1. Esaminare quotidianamente la ferita chirurgica per verificare la presenza di infezioni, integrità della sutura o altri problemi e rimuovere i residui di sutura, se necessario, 15 giorni dopo l'intervento.

6. Eutanasia

1. Eutanasia degli animali utilizzando una camera di CO₂ , secondo le linee guida del National Institutes of Health (NIH), con un tasso di riempimento di CO₂ del 30%-70% del volume della camera/min dopo il tempo di impianto (4 settimane o 12 settimane).

7. Analisi post-chirurgica

1. Per entrambi i modelli (osteoporosi e diabete), rimuovere la tibia mediante disarticolazione dopo l'eutanasia per ulteriori analisi.
   NOTA: Per quanto riguarda l'analisi micro-CT, dati consentiti per il calcolo del contatto osso-impianto (BIC). L'acquisizione TC è stata condotta utilizzando i parametri precedentemente descritti, e l'analisi BIC è stata eseguita dividendo l'area ossea (mm²) per l'area implantare (mm²) calcolata in corrispondenza della regione corticale, adattando un protocollo già descritto in letteratura¹⁸. Vengono mostrate immagini rappresentative per ciascun modello, osteoporosi (Figura 9) e diabete (Figura 10).

Risultati

Fase chirurgica
È importante ricordare che entrambi i modelli animali utilizzati in questo studio presentano alcuni vincoli dovuti alle malattie indotte. Questi vincoli relativi alla manipolazione dei tessuti duri e molli si riflettono durante la procedura chirurgica.

Nel modello diabetico, il ratto è più grande, il che rende difficile stabilizzare le zampe durante le procedure chirurgiche. Questo aumenta il tempo chirurgico e, di conseg...

Discussione

Sebbene il ratto sia un modello ampiamente utilizzato per lo studio dell'osteointegrazione, è importante definire e descrivere una tecnica chirurgica riproducibile per posizionare adeguatamente gli impianti. Tale tecnica potrebbe servire da guida per la comunità scientifica. Inoltre, il fatto che alcune malattie, come l'osteoporosi e il diabete, alterino il metabolismo osseo implica una maggiore necessità di progettare correttamente le procedure chirurgiche. Il ratto si confronta favo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G needles+A2:C30	Terumo	NN-2238R
4/0 monofilament synthetic resorbable suture	Braun ( MonoSyn)
5 mL, 10 mL syringes	Braun	4617100V-02 4606051V
Adson forceps	Antão Medical	Ref: A586
BBDR ( Biobreeding Diabetes Resistant ) Sprague Dawley Rats	Janvier Labs
Betadine	Mylan
Buprecare	Animalcare (UK)
Castroviejo Caliper 0-40 mm 15 cm angled	UL AMIN Industries
Castroviejo Needle Holder	Antão Medical	Ref: AM1702
Dental surgery scissors curved and straight	Antão Medical	AMA603 / AMA600
Electric shaver	Oster Pro 3000i	34264482227
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T	Ref: 11150-10
Gauze pads	COVIDIEN	441001
Glucometer	Menarini (Italy)
Helicoidal Drill / OSTEO-PIN DRILL Ø1.6 mm	soadco	Ref. OS-8001
Implants / SCREW OSTEO-PIN Ø1.8 x 2.0 mm	soadco	Ref. OS-3
Isoflo	Le Vet Pharma (Netherlands)
Lance pilot drill / Lanceolate Drill (DS)	soadco	Ref. 10 02 01 T
Latex gloves - Surgical gloves sterile	Hartmann	Ref: 9426495
Lucas Surgical Curette	Antão Medical	Ref: AMA940-3
Metacam	Boehringer Ingelheim(Germany)
Micro forceps straight	nopa	Ref: AB 542/12
Micro-CT scan( Quantum Fx microCT )	Perkin Elmer (US)
Osteoporotic Sprague Dawley females Rats	Janvier Labs
Periosteal elevator -  Molt 2-4	Antão Medical	Ref: A1564
Physiologic solution for Irrigation	Hygitech	Ref:10238
Scalpel Blade Carbon Steel 15C	Razor Med	Ref: 02846
Sterile Gauze Swabs	Alledental	Ref: 270712
Sterile Irrigation system	Hygitech	Ref:HY1-110001D
Sterile towels (1 piece per animal)	Dinarex	4410
Surgical contra-angle handpiece	W&H	Ref: WS-75 LED G
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 08877
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 01309
Surgical Electric Motor	WH Implantmed Type: SI-1023	Ref: 30288000
Surgical scalpel handle	AsaDental	Ref: 0350-3
Towel clamps	Xelpov surgical	AF-773-11
Ultrasonic device	J.P. Selecta, Abrera, Spain