Sıçan Tibia Diyabet ve Osteoporoz Modellerinde Cerrahi Kemik İmplantasyon Tekniği

Özet

İmplantların bir sıçan modeline yerleştirilmesi, klinik araştırmalar için önemli bir deneysel prosedürdür. Bu çalışma, diyabet ve osteoporozlu sıçan modellerinin tibiasına titanyum implantların implante edilmesi için kapsamlı bir cerrahi protokol sunmaktadır.

Özet

Sıçan, implant diş hekimliği ve ortopedide, özellikle biyomalzemeler ve kemik dokusu arasındaki etkileşimlerin incelenmesinde uzun süredir değerli bir hayvan modeli olarak hizmet etmiştir. Sıçanın kaval kemiği, ince doku katmanlarından (deri ve kas) kolay cerrahi erişimi ve medial yüzünün düzleştirilmiş şekli nedeniyle sıklıkla seçilir ve intraosseöz cihazların cerrahi olarak yerleştirilmesini kolaylaştırır. Ek olarak, bu model, geometri, yüzey dokusu veya biyolojik ipuçları gibi farklı implant koşullarına biyolojik tepkileri değerlendirmek için çeşitli klinik koşulları taklit ederek belirli hastalıkların indüksiyonunu sağlar. Bununla birlikte, sağlam kortikal yapısına rağmen, bazı intraosseöz cihazlar, başarılı implantasyon için tasarım ve boyutta uyarlamalar gerektirebilir. Bu nedenle, implantasyon bölgesindeki hem yumuşak hem de sert dokuları manipüle etmek için standartlaştırılmış cerrahi yöntemlerin oluşturulması, özellikle implant diş hekimliği ve ortopedi gibi alanlarda uygun implant veya vidalı cihaz yerleşimini sağlamak için çok önemlidir. Bu çalışma, kendi hastalıklarına göre iki gruba ayrılan seksen Sprague Dawley sıçanını içeriyordu: Grup 1 osteoporozlu ve Grup 2 Tip 2 Diyabetli. İmplantasyonlar 4 hafta ve 12 haftada, aynı cerrah tarafından tutarlı bir cerrahi teknik izlenerek gerçekleştirildi. Yerleştirilen tüm implantların tam osseointegrasyonunu gösteren pozitif bir biyolojik yanıt gözlendi. Bu sonuçlar, diğer çalışmalar için tekrarlanabilen ve biyomalzeme topluluğu için bir ölçüt görevi gören cerrahi protokolün başarısını doğrulamaktadır. Özellikle, osseointegrasyon değerleri her iki hastalık modeli için hem 4 haftada hem de 12 haftada sabit kaldı, bu da implantın zaman içinde kalıcı bir entegrasyonunu gösterdi ve 4 hafta gibi kısa bir sürede yakın bir kemik bağlantısının kurulmasını vurguladı.

Giriş

Sıçanların deney denekleri olarak yaygın olarak tercih edilmesi, daha büyük hayvan modellerine kıyasla üremelerinin kolay ve nispeten ucuz olmalarından kaynaklanmaktadır. Osteoporoz veya diyabet gibi bir bozukluğun güvenilir bir şekilde yeniden üretilmesi gibi yeni prosedürlerin ortaya çıkması, bu modeli, tedavilerin potansiyel kullanımını ve/veya hastalığın ilaçlara ve cerrahi cihazlara veya prosedürlere biyolojik yanıttaki etkisini analiz etmek için özellikle yararlı hale getirir ^1,2.

Sıçanın kemik kütlesi kazanımı çoğunlukla yaşamın ilk 6 ayında meydana gelir, ancak bazı araştırmacılar uzun kemiğin en az bir yıl boyunca sürekli olarak büyüdüğüne ve uzunlukta^ilerleyici bir artışla 1 olduğuna inanmaktadır. Yaşlanma ile birlikte, modellemeden yeniden şekillenmeye geçiş vardır, bu da her durumda kemikler boyunca eşit olarak gerçekleşmez². Dişi Sprague Dawley sıçanları, erkek sıçanlardan daha yavaş büyür ve erkek sıçanlara göre daha düşük bir ağırlık zirvesine ulaşır¹. Sıçanlarda sürekli kemik uzaması ve çeşitli kemik yeniden şekillenme dinamikleri, insan sağlığı sorunlarını ele alırken dikkate alınması gereken faktörlerdir; Bununla birlikte, yaşam boyu sıçan kemiği gelişimini veya türün kemik^1'i yeniden şekillendirme konusundaki yetersizliğini gösteren herhangi bir deneysel araştırma bulmak henüz mümkün olmamıştır. Deney yaklaşık 10 aylıkken başlarsa, bu uzunlamasına kemik büyümesi nedeniyle tibianın büyüme plağından en az 1 mm'lik bir kenar sağlam bırakılmalıdır, bu da dental implant çalışmalarında dikkate alınması gereken bir konudur². Hormonlar da kemik araştırmalarında önemli bir parametredir, çünkü 8 aylıkken erkek sıçanların tibiadaki dişilere göre %22 daha fazla kemik genişliğine ve %33 daha fazla kırılma mukavemetine sahip olduğu bulunmuştur³.

Bu nedenle, bir ortopedik vidanın veya bir diş implantının osseointegrasyonu, cihazın kemiğe implantasyonuna sistemik yanıtı etkileyen çok sayıda faktöre bağlı olan karmaşık bir süreç olduğundan, bir bozukluğun güvenilir bir şekilde çoğaltılması ortopedi ve implant diş hekimliğinde çok önemlidir. Osteoporoz ve diyabet gibi sistemik bozuklukların ortopedi ve implant diş hekimliğinde başarı oranını etkilediği bilinmektedir, bu nedenle bu bozuklukların sıçan modellerinde güvenilir bir şekilde çoğaltılması, bu sınırlamaların üstesinden gelmenin yollarını araştırmak için uygulanabilir.

Sıçan tibiası, kolay cerrahi erişim, orta derecede kemik hacmi ve medial plaka üzerindeki düz şekli nedeniyle, cerrahi kemik implantasyon deneyleri için uygun hale getirir ^4,5 ve implant yüzeyinin osseointegrasyon üzerindeki etkilerini araştıran çok sayıda araştırma çalışmasında kullanılmıştır ^4,5,6. Giderek artan sayıda çalışma, hem sağlıklı hayvanlarda⁷ hem de diyabet veya osteoporozdan etkilenen riskli hayvanlarda 8,9,10,11,12,13,14 implant yüzeyine eklenen kaplamaların ve maddelerin osseointegrasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmektedir.

Bir sıçanın kaval kemiğine yerleştirilen implant cihazlarının sayısı sınırlıdır ve çalışmanın türüne bağlı olarak değişebilir. İmplant sayısına veya çalışma koşullarına bağlı olarak, cihazların boyutları cerrahi travmayı en aza indirecek şekilde uyarlanmalıdır. Tek implant ile yapılan çalışmalarda, neredeyse insan boyutunda bir implant yerleştirilebilir (2.0 mm çapında ve 4 ila 5 mm uzunluğunda) ve bikortikal ankraj sağlanabilir 6,7,15,16. Çoklu implant protokollerindeki implantların boyutları uygun bir implant boyutunu (1,5 mm çapında ve 2,5 mm uzunluğunda) ^{benimsemelidir4,17}.

Bu çalışmanın amacı, osteoporoz ve diyabet sıçan modeli olmak üzere iki sıçan modelinin tibiasına titanyum implant yerleştirilmesi için standart bir cerrahi protokolü tanımlamaktır. Ayrıca, bu çalışma, farklı implant yüzeyi biyofonksiyonelleştirme tiplerini ve bunun osseointegrasyon üzerindeki etkisini değerlendirmek için cerrahi protokolün test edilmesine izin vermektedir.

80 sıçandan oluşan bir örnek iki gruba ayrıldı. Grup 1'de, ortalama ağırlığı 484 g ve ortalama yaşı 12 hafta olan 40 yumurtalıklı Sprague Dawley dişisi ve 5 sahte hayvan seçildi. Tedarikçi tavsiyelerine göre (Malzeme Tablosuna bakınız), kısırlaştırmadan üç ay sonra deney başladı. Bu bekleme süresi seks hormonlarının ortadan kalkmasını sağladı. Osteoporoz, mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) kemik analizine dayalı olarak ameliyat sırasında doğrulandı ve bu, sahte gruba kıyasla ortalama% 20 kemik kaybını yansıtıyordu. Grup 2, tip II diyabetli 40 BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) genetik modifiye Sprague Dawley sıçanından oluşuyordu. Ortalama ağırlık 730 g ve ortalama yaş 12 hafta idi. Ameliyattan önce, diyabetik durum, 200 mg / dL'den daha yüksek sonuçlarla art arda üç günlük glikoz ölçümleri ile doğrulandı. Açlıktan 6 saat sonra glukometre ile glukoz ölçümü yapıldı ve kuyruk ponksiyonu ile bir kan damlası toplandı.

Hastaların boyları 2 mm ve çapları 1.8 mm olan grade 3 titanyum implantlar kullanıldı. Tüm implantlar temiz oda koşullarında, ultrason banyosu (230 VAC, 50/60 Hz, 360 W) kullanılarak sikloheksan (2 dakika boyunca 3 kez), aseton (1 dakika boyunca bir kez), deiyonize su (2 kez 2 kez), etanol (2 kez 2 dakika boyunca) ve aseton (2 dakika boyunca 3 kez) ile ultrasonik olarak temizlenerek sterilize edildi. Daha sonra numuneler nitrojen gazı ile kurutuldu ve 0.5 bar'da bir nitrojen demeti doğrudan numunelerin üzerine uygulandı. İmplantasyondan önce, implantlar önce deiyonize suya batırıldı ve daha sonra 10 dakika boyunca% 70 etanol (h / h) içine daldırıldı. Daha sonra implantlar steril mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı ve ameliyata kadar steril şartlarda bekletildi.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler, İspanyol hukukunda (Kraliyet Kararnamesi 53/2013) ve Generalitat de Catalunya yönetmeliklerinde (Kararname 214/97) uygulandığı şekliyle bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin Avrupa Topluluğu Kılavuzlarına (Direktif 2010/63/EU) uygun olarak yürütülmüştür. Tüm hayvan prosedürleri ve kullanımı için etik onay, Vall D'Hebron Institut de Recerca'nın Hayvan Deneyleri Etik Kurulu'ndan (kayıt numarası 72/18 CEEA) alınmıştır. Osteoporotik model için ortalama ağırlığı 484 g ve yaş ortalaması 12 hafta olan dişi Sprague Dawley sıçanları kullanıldı. Diyabetik modelde ise ortalama ağırlığı 730 g ve yaş ortalaması 12 hafta olan genetiği değiştirilmiş dişi BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) cinsi fareler kullanıldı. Tüm hayvanlar ticari bir tedarikçiden temin edildi. Çalışmada kullanılan hayvanların, reaktiflerin ve ekipmanın spesifik ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Anestezi / farmakoloji ve hayvanların hazırlanması

1. Cerrahi işleme başlamadan 10-15 dakika önce deri altı enjeksiyonlar yoluyla 0.05 mg / kg'da buprenorfin ve 2 mg / kg'da meloksikam kullanarak cerrahi öncesi analjezi uygulayın.
2. Solunan izofluran ile intracerrahi anestezi yapın: indüksiyon sırasında temiz havada% 5'te başlatın ve% 3'te tutun. Bir sıçan odasında anesteziyi indükleyin ve ameliyat sırasında konik bir burun adaptasyonu ile izofluran beslemesini koruyun.

2. Ameliyat için hazırlık

1. Anestezi uygulanan hayvanın vücut ısısını bir rektal prob ile ölçün ve cerrahi prosedür boyunca termal destek için elektronik olarak kontrol edilen bir ısıtma yastığı kullanın. Kornea kuruluğunu önlemek için ameliyat başlamadan önce göz merhemi uygulanmalıdır.
   NOT: Gerekirse, göz kuruluğu kontrol edildikten sonra merhem tekrar uygulanmalıdır.
2. Saçları elektrikli tıraş makinesiyle düzeltin ve kalan tüyleri gidermek için tüy dökücü krem uygulayın.
3. Diz cildini steril sürüntüler kullanarak iyot ve %70 (h/h) etanol şeklinde temizleyerek, insizyon hattının içinden başlayıp geri çekilmeden dışa doğru hareket ettirerek aseptik bir cerrahi alan elde edin. En az üç ardışık temizleme rotasyonu gerçekleştirin (iyot-etanol-iyot).
4. Hayvanın üzerine steril bir fenestre cerrahi örtü yerleştirerek ve bacağı merkezi açıklıktan açığa çıkararak ameliyat alanını izole edin (Şekil 1).

3. Cerrahi

1. Cerrahi maruziyet
   1. Kemiği ortaya çıkarmak için metafiz bölgesinde, tibianın anteromedial yüzünün proksimal sınırı boyunca dikey olarak yaklaşık 1 cm uzunluğunda tam kat bir cilt kesisi yapın (Şekil 2).
   2. Kesi yaparken bacağı stabilize edin ve cildi alttaki kemiğe doğru gergin bir şekilde çekin, böylece temiz bir kesi doğru yerde kalır. Beklenen hafif kanamayı tuzlu su çözeltisine batırılmış bir kompres ile temizleyerek yönetin (Şekil 2).
      NOT: Sıçan derisi ince ve sarkık veya gevşektir. Cildin stabilizasyonu çok önemlidir ve gereklidir.
   3. Küçük periosteal asansörler kullanarak dokuyu kemikten tamamen ayırın (Şekil 3).
   4. Tibialis kranialis kası, gracilis ve gastroknemius lateral kafa kasının, tibianın medial yönünün arka sınırında, kemiğe sıkıca yapışmış fibröz beyaz bir doku olarak yerleştirilmesi tanımlanana kadar kemiği açığa çıkarın (Şekil 3).
      NOT: İmplantın, sıçanın boyutundan bağımsız olarak tüm numune boyunca benzer özelliklere ve uyaranlara sahip bir kemik bölgesine yerleştirilmesini sağlamak için bu kas yerleştirme grubunu tanımlamak önemlidir.
2. Delme işlemi
   1. Delme işlemine, herhangi bir kas yaralanmasından kaçınarak, tibialis kranialis kası, grasilis ve gastroknemius lateral kafa kasının yerleştirilmesine bitişik olarak, proksimal tibial tepe ile tibia kemiğinin medial yüzünün arka sınırı arasındaki doğru bölgeden başlayın.1
      NOT: Doğru konum tibial platodan 5 mm ± 2 mm uzakta olmalıdır.
   2. 20:1 redüksiyon kontra açısına sahip cerrahi bir elektrik motoruyla 20 °C'ye yakın bir sıcaklıkta tuzlu solüsyon sulaması altında maksimum 150 rpm (devir/dk) ile delin.
      NOT: Sadece iki matkap gerekliydi.
   3. Tuzlu su çözeltisi sulaması altında 2,4 mm derinlikte bir mızrak pilot matkabı (Şekil 4) ile başlayın.
      NOT: Her matkabın en fazla 10 kullanımı vardı.
   4. İkinci bir matkap olarak, (Şekil 4) tuzlu su çözeltisi altında 2.4 mm çapında 1.6 mm derinlikte bir büküm tasarımlı matkap kullanın.
      NOT: Her matkabın en fazla 10 kullanımı vardı.
3. İmplant yerleştirme
   1. İmplantı, 20:1 redüksiyon kontraj açısına bağlı bir ara parça (Şekil 5) ile yerleştirin.
   2. İmplantı yerleştirmeden önce, implantı 10 saniye boyunca eşzamanlı tuzlu sulama ile ters açıda döndürerek herhangi bir kalıntı kimyasal sterilanttan temizleyin (Şekil 5).
   3. Titanyum implantı (2 mm uzunlamasına ve 1,8 mm çapında) 20 rpm'de ara parçayı kullanarak gerçek zamanlı tork değerini izlerken yerleştirin ve maksimum yerleştirme torkunu kaydedin.
      NOT: Son matkap ile implant arasındaki farkın yanı sıra implantın silindirik profili nedeniyle implantın yerleştirilmesinde ilk zorluk beklenir; Bununla birlikte, bu ilk zorluk, implant ilk kortikal kemiğe nüfuz eder etmez hızla normalleşir.
   4. İmplant yerleştirmeyi, yerleştirildiği kortikal kemiği, yani tibianın düz medial yüzünü tamamen geçmeden bitirin.
      NOT: İmplant yerleştirilmesinin son anında, implantın kortikal kemiğin biraz dışında veya yerleştirildiği kortikal kemikle aynı seviyede, yani tibianın düz medial yüzü ile aynı seviyede bırakılması, primer stabiliteyi sağlamak açısından önemlidir (Şekil 6).
4. Yara kapatma
   1. Kas dokusu sınırlarını 4/0 monofilament sentetik emilebilir sütür (Glisonat) kullanarak basit iç sütürlerle dikin (Şekil 7).
   2. 4/0 monofilament sentetik emilebilir sütür (Glisonat) kullanarak intradermal sütür ile cilt kapatma işlemi gerçekleştirin (Şekil 7).

4. Mikro-CT taraması

1. Ameliyatı tamamladıktan ve hala genel anestezi altında kaldıktan sonra, uygun implant yerleşimini doğrulamak için bir mikro-BT taraması yapın.
2. Fareyi ameliyat yatağından çıkarın ve tarama yatağına yerleştirin. Mikro-CT canlı tarama modunu kullanarak ameliyat edilen bacağın yerini belirleyin ve Görüş Alanını implant üzerinde ortalayın.
   NOT: Önerilen toplama parametreleri 5 mm görüş alanı, 0.0001 mm^{uzamsal çözünürlük 3}, 50 kV, 200 μA ve 3 dakikalık çekim süresidir.
3. Tarama yapıldıktan sonra, adım 5.2.1'e göre implantın proksimal yönü ile tibial platonun yüzeyi arasındaki doğru mesafeyi onaylayın.
   NOT: Bu değer, tekniğin standardizasyonu için yardımcı olacaktır (Şekil 8).

5. Ameliyat sonrası bakım

1. Görüntüleme alımını takiben, fareyi kafesine geri koyun ve tamamen iyileşene kadar izleyin.
   NOT: Bu, hayvan modeline bağlı olarak yaklaşık 5-10 dakika sürer. Diyabetik sıçanların diyabetle ilişkili metabolik değişiklikler nedeniyle daha uzun süre anestezi altında kalması ve daha uzun bir iyileşme süresine sahip olması beklenmektedir.
2. Her 6-8 saatte bir buprenorfin (0.1 mg / kg) ve her 24 saatte bir meloksikam (5 mg / kg) deri altından 72 saate kadar uygulayın.
3. Sütür alma süresi
   1. Cerrahi yarayı enfeksiyon, sütür bütünlüğü veya diğer sorunlar açısından günlük olarak inceleyin ve gerekirse ameliyattan 15 gün sonra dikiş kalıntılarını çıkarın.

6. Ötenazi

1. Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergelerine göre, implantasyon süresinden sonra (4 hafta veya 12 hafta) oda hacminin/dakikasının %30-70'i kadar bir CO 2 doldurma oranı ile bir CO_{2 odası kullanarak} hayvanlara ötenazi yapın.

7. Ameliyat sonrası analiz

1. Her iki model için de (osteoporoz ve diyabet), daha fazla analiz için ötenaziden sonra dezartikülasyon yoluyla tibiayı çıkarın.
   NOT: Mikro-BT analizi ile ilgili olarak, veriler kemik-implant temasının (BIC) hesaplanmasına izin verdi. BT edinimi daha önce tarif edilen parametreler kullanılarak gerçekleştirildi ve BIC analizi, kemik alanının (mm²) kortikal bölgede hesaplanan implant alanına (mm²) bölünmesiyle gerçekleştirildi ve literatürde daha önce açıklanan bir protokole uyarlandı¹⁸. Her model, osteoporoz (Şekil 9) ve diyabet (Şekil 10) için temsili görüntüler gösterilmiştir.

Sonuçlar

Cerrahi aşama
Bu çalışmada kullanılan her iki hayvan modelinin de indüklenen hastalıklar nedeniyle belirli kısıtlamalar sunduğunu belirtmek önemlidir. Sert ve yumuşak dokuların manipülasyonu ile ilgili bu kısıtlamalar cerrahi işlem sırasında yansıtılır.

Diyabetik modelde, sıçan daha büyüktür ve cerrahi prosedürler sırasında bacakları stabilize etmeyi zorlaştırır. Bu, ameliyat süresini ve dolayısıyla daha...

Tartışmalar

Sıçan, osseointegrasyonu incelemek için yaygın olarak kullanılan bir model olmasına rağmen, implantları uygun şekilde yerleştirmek için tekrarlanabilir bir cerrahi tekniği tanımlamak ve tanımlamak önemlidir. Böyle bir teknik, bilim camiası için bir rehber görevi görebilir. Ayrıca, osteoporoz ve diyabet gibi bazı hastalıkların kemik metabolizmasını değiştirmesi, cerrahi prosedürlerin doğru şekilde tasarlanması için daha güçlü talepler anlamına gelir. S...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G needles+A2:C30	Terumo	NN-2238R
4/0 monofilament synthetic resorbable suture	Braun ( MonoSyn)
5 mL, 10 mL syringes	Braun	4617100V-02 4606051V
Adson forceps	Antão Medical	Ref: A586
BBDR ( Biobreeding Diabetes Resistant ) Sprague Dawley Rats	Janvier Labs
Betadine	Mylan
Buprecare	Animalcare (UK)
Castroviejo Caliper 0-40 mm 15 cm angled	UL AMIN Industries
Castroviejo Needle Holder	Antão Medical	Ref: AM1702
Dental surgery scissors curved and straight	Antão Medical	AMA603 / AMA600
Electric shaver	Oster Pro 3000i	34264482227
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T	Ref: 11150-10
Gauze pads	COVIDIEN	441001
Glucometer	Menarini (Italy)
Helicoidal Drill / OSTEO-PIN DRILL Ø1.6 mm	soadco	Ref. OS-8001
Implants / SCREW OSTEO-PIN Ø1.8 x 2.0 mm	soadco	Ref. OS-3
Isoflo	Le Vet Pharma (Netherlands)
Lance pilot drill / Lanceolate Drill (DS)	soadco	Ref. 10 02 01 T
Latex gloves - Surgical gloves sterile	Hartmann	Ref: 9426495
Lucas Surgical Curette	Antão Medical	Ref: AMA940-3
Metacam	Boehringer Ingelheim(Germany)
Micro forceps straight	nopa	Ref: AB 542/12
Micro-CT scan( Quantum Fx microCT )	Perkin Elmer (US)
Osteoporotic Sprague Dawley females Rats	Janvier Labs
Periosteal elevator -  Molt 2-4	Antão Medical	Ref: A1564
Physiologic solution for Irrigation	Hygitech	Ref:10238
Scalpel Blade Carbon Steel 15C	Razor Med	Ref: 02846
Sterile Gauze Swabs	Alledental	Ref: 270712
Sterile Irrigation system	Hygitech	Ref:HY1-110001D
Sterile towels (1 piece per animal)	Dinarex	4410
Surgical contra-angle handpiece	W&H	Ref: WS-75 LED G
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 08877
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 01309
Surgical Electric Motor	WH Implantmed Type: SI-1023	Ref: 30288000
Surgical scalpel handle	AsaDental	Ref: 0350-3
Towel clamps	Xelpov surgical	AF-773-11
Ultrasonic device	J.P. Selecta, Abrera, Spain