Técnica de Implante Ósseo Cirúrgico para Modelos de Diabetes e Osteoporose na Tíbia de Ratos

Resumo

A colocação de implantes em um modelo de rato é um procedimento experimental essencial para a pesquisa clínica. Este estudo apresenta um protocolo cirúrgico abrangente para implante de implantes de titânio na tíbia de modelos de ratos com diabetes e osteoporose.

Resumo

O rato há muito serve como um modelo animal valioso em implantodontia e ortopedia, particularmente no estudo das interações entre biomateriais e tecido ósseo. A tíbia do rato é frequentemente escolhida devido ao seu fácil acesso cirúrgico através de finas camadas de tecido (pele e músculo) e ao formato achatado de sua face medial, facilitando a inserção cirúrgica de dispositivos intraósseos. Além disso, este modelo permite a indução de doenças específicas, imitando várias condições clínicas para avaliar as respostas biológicas a diferentes condições de implante, como geometria, textura da superfície ou pistas biológicas. No entanto, apesar de sua estrutura cortical robusta, certos dispositivos intraósseos podem exigir adaptações no design e no tamanho para uma implantação bem-sucedida. Portanto, estabelecer métodos cirúrgicos padronizados para manipular tecidos moles e duros na região de implantação é essencial para garantir a colocação adequada do implante ou dispositivo de parafuso, particularmente em áreas como implantodontia e ortopedia. Este estudo incluiu oitenta ratos Sprague Dawley divididos em dois grupos com base em suas respectivas doenças: Grupo 1 com osteoporose e Grupo 2 com Diabetes Tipo 2. Os implantes foram realizados em 4 semanas e 12 semanas, com o mesmo cirurgião seguindo uma técnica cirúrgica consistente. Foi observada uma resposta biológica positiva, indicando osseointegração completa de todos os implantes colocados. Esses resultados validam o sucesso do protocolo cirúrgico, que pode ser replicado para outros estudos e servir de referência para a comunidade de biomateriais. Notavelmente, os valores de osseointegração permaneceram estáveis em 4 semanas e 12 semanas para ambos os modelos de doença, demonstrando uma integração durável do implante ao longo do tempo e enfatizando o estabelecimento de uma conexão óssea íntima já em 4 semanas.

Introdução

A escolha comum de ratos como sujeitos experimentais se deve ao fato de serem fáceis de reproduzir e relativamente baratos em comparação com modelos animais maiores. O surgimento de novos procedimentos, como a reprodução confiável de um distúrbio, por exemplo, osteoporose ou diabetes, torna esse modelo especialmente útil para analisar o uso potencial de tratamentos e/ou a influência da doença na resposta biológica a drogas e dispositivos ou procedimentos cirúrgicos ^1,2.

O ganho de massa óssea do rato ocorre principalmente durante os primeiros 6 meses de vida, embora alguns pesquisadores acreditem que o osso longo cresça constantemente por pelo menos um ano com um aumento progressivo no comprimento¹. Com o envelhecimento, há uma transição da modelagem para a remodelação, que não ocorre em todos os casos igualmente em todos os ossos². As ratas Sprague Dawley fêmeas crescem mais lentamente do que os ratos machos e atingem um pico de peso mais baixo do que os ratos machos¹. O alongamento ósseo contínuo e a dinâmica variada da remodelação óssea em ratos são fatores que devem ser levados em consideração ao abordar questões de saúde humana; No entanto, ainda não foi possível encontrar nenhuma pesquisa experimental que mostre o desenvolvimento ósseo de rato ao longo da vida ou a incapacidade da espécie de remodelar o osso¹. Se a experimentação começar por volta dos 10 meses de idade, uma margem de pelo menos 1 mm da placa de crescimento da tíbia deve ser deixada intacta devido a esse crescimento ósseo longitudinal, uma questão a ser considerada em estudos com implantes dentários². Os hormônios também são um parâmetro chave na pesquisa óssea, pois aos 8 meses de idade, os ratos machos apresentaram largura óssea 22% maior e resistência à ruptura 33% maior do que as fêmeas na tíbia³.

A reprodução confiável de um distúrbio é, portanto, muito importante na ortopedia e na implantodontia, uma vez que a osseointegração de um parafuso ortopédico ou implante dentário é um processo complexo que depende de vários fatores que influenciam a resposta sistêmica ao implante do dispositivo no osso. Sabe-se que distúrbios sistêmicos como osteoporose e diabetes afetam a taxa de sucesso em ortopedia e implantodontia, portanto, a reprodução confiável desses distúrbios em modelos de ratos pode ser aplicada para explorar maneiras de superar essas limitações.

A tíbia de ratos, devido ao fácil acesso cirúrgico, volume ósseo moderado e formato achatado na placa medial, a torna adequada para experimentos cirúrgicos de implante ósseo ^4,5, e tem sido utilizada em inúmeras pesquisas que exploram os efeitos da superfície do implante na osseointegração ^4,5,6. Um número crescente de estudos avalia os efeitos na osseointegração de revestimentos e substâncias adicionadas à superfície do implante em animais saudáveis⁷ e em animais comprometidos afetados por diabetes ou osteoporose 8,9,10,11,12,13,14.

O número de dispositivos de implante colocados na tíbia de um rato é limitado e pode diferir dependendo do tipo de estudo. Dependendo do número de implantes ou condições de estudo, as dimensões dos dispositivos devem ser adaptadas para minimizar o trauma cirúrgico. Em estudos com um implante, um implante de tamanho quase humano pode ser colocado (2,0 mm de diâmetro e 4 a 5 mm de comprimento), e a ancoragem bicortical pode ser alcançada 6,7,15,16. As dimensões dos implantes em protocolos multiimplantares devem adotar um tamanho de implante adequado (1,5 mm de diâmetro e 2,5 mm de comprimento)^4,17.

O presente estudo tem como objetivo descrever um protocolo cirúrgico padronizado para colocação de implante de titânio na tíbia de dois modelos de ratos: o modelo de osteoporose e o modelo de rato com diabetes. Além disso, este estudo permite testar o protocolo cirúrgico para avaliar diferentes tipos de biofuncionalização da superfície do implante e seu efeito na osseointegração.

Uma amostra de 80 ratos foi dividida em dois grupos. No grupo 1, foram selecionadas 40 fêmeas de Sprague Dawley ovariectomizadas e 5 animais sham, com peso médio de 484 g e idade média de 12 semanas. Com base nas recomendações do fornecedor (consulte a Tabela de Materiais), três meses após a castração, o experimento começou. Esse período de espera garantiu o desaparecimento dos hormônios sexuais. A osteoporose foi confirmada no momento da cirurgia com base na análise óssea da microtomografia computadorizada (micro-CT), que refletiu uma média de 20% de perda óssea em comparação com o grupo simulado. O grupo 2 consistiu em 40 ratos Sprague Dawley geneticamente modificados BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) com diabetes tipo II. O peso médio foi de 730 g e a idade média foi de 12 semanas. Antes da cirurgia, o estado diabético foi confirmado com três dias consecutivos de medidas de glicose com resultados superiores a 200 mg/dL. A glicose foi medida com glicosímetro em 6 h de jejum, e uma gota de sangue foi coletada por punção da cauda.

Foram utilizados implantes de titânio grau 3 medindo 2 mm de comprimento e 1,8 mm de diâmetro. Todos os implantes foram esterilizados em sala limpa, sendo limpos por ultrassom em ciclohexano (3 vezes por 2 min), acetona (uma vez por 1 min), água deionizada (3 vezes por 2 min), etanol (3 vezes por 2 min) e acetona (3 vezes por 2 min) usando um banho de ultrassom (230 VAC, 50/60 Hz, 360 W). Em seguida, as amostras foram secas com gás nitrogênio e um feixe de nitrogênio a 0,5 bar foi aplicado diretamente sobre as amostras. Antes do implante, os implantes foram primeiro embebidos em água deionizada e, em seguida, imersos em etanol a 70% (v/v) por 10 min. Em seguida, os implantes foram transferidos para tubos de microcentrífuga estéreis e mantidos em condições estéreis até a cirurgia.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as Diretrizes da Comunidade Europeia para a proteção de animais utilizados para fins científicos (Diretiva 2010/63/UE) conforme implementadas na legislação espanhola (Real Decreto 53/2013) e nos regulamentos da Generalitat de Catalunya (Decreto 214/97). A aprovação ética para todos os procedimentos e manuseamento animal foi obtida do Comitê de Ética em Experimentação Animal do Vall D'Hebron Institut de Recerca (número de registro 72/18 CEEA). Para o modelo osteoporótico, foram utilizadas ratas Sprague Dawley com peso médio de 484 g e idade média de 12 semanas. Quanto ao modelo diabético, foram empregadas ratas geneticamente modificadas BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) com peso médio de 730 g e idade média de 12 semanas. Todos os animais foram adquiridos de um fornecedor comercial. Os detalhes específicos dos animais, reagentes e equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Anestesia/farmacologia e preparação de animais

1. Administrar analgesia pré-cirúrgica com buprenorfina a 0,05 mg/kg e meloxicam a 2 mg/kg por meio de injeções subcutâneas 10-15 min antes de iniciar o procedimento cirúrgico.
2. Realize anestesia intracirúrgica com isoflurano inalatório: iniciar a 5% em ar fresco durante a indução e manter a 3%. Induza a anestesia em uma câmara de rato e mantenha o suprimento de isoflurano com uma adaptação cônica do nariz durante a cirurgia.

2. Preparação para a cirurgia

1. Meça a temperatura corporal do animal anestesiado com uma sonda retal e use uma almofada de aquecimento controlada eletronicamente para suporte térmico durante todo o procedimento cirúrgico. A pomada ocular deve ser aplicada antes do início da cirurgia para evitar o ressecamento da córnea.
   NOTA: Se necessário, a pomada deve ser reaplicada após verificar o ressecamento dos olhos.
2. Apare o cabelo com um barbeador elétrico e aplique creme depilatório para eliminar qualquer pelo restante.
3. Obtenha um campo cirúrgico asséptico limpando a pele do joelho em um padrão de iodo e etanol 70% (v/v) usando swabs estéreis, começando de dentro e movendo-se para fora da linha de incisão sem refazer. Realize um mínimo de três rotações de limpeza consecutivas (iodo-etanol-iodo).
4. Isole o campo operatório posicionando um campo cirúrgico fenestrado estéril sobre o animal, expondo a perna através da abertura central (Figura 1).

3. Cirurgia

1. Exposição cirúrgica
   1. Faça uma incisão cutânea de espessura total de aproximadamente 1 cm de comprimento verticalmente ao longo da borda proximal da face anteromedial da tíbia, na região da metáfise para expor o osso (Figura 2).
   2. Estabilize a perna e puxe a pele esticada contra o osso subjacente enquanto faz a incisão, garantindo que uma incisão limpa permaneça no local correto. Gerencie limpando o sangramento leve esperado com uma compressa embebida em solução salina (Figura 2).
      NOTA: A pele do rato é fina e flácida ou solta. A estabilização da pele é crucial e necessária.
   3. Descole totalmente o tecido do osso usando pequenos elevadores periosteal (Figura 3).
   4. Expor o osso até a identificação da inserção do músculo tibial cranial, grácil e gastrocnêmio lateral da cabeça na borda posterior da face medial da tíbia, como um tecido branco fibroso firmemente aderido ao osso (Figura 3).
      NOTA: É importante identificar esse grupo de inserções musculares para permitir que o implante seja colocado em uma região óssea com características e estímulos semelhantes em toda a amostra, independentemente do tamanho do rato.
2. Processo de perfuração
   1. Iniciar o processo de perfuração na região correta entre a crista tibial proximal e o limite posterior da face medial do osso tíbia, contígua à inserção do músculo tibial cranial, grácil e gastrocnêmio lateral da cabeça, evitando qualquer lesão muscular.1
      NOTA: A localização correta deve ser de 5 mm ± 2 mm do platô tibial.
   2. Broca com um máximo de 150 rpm (rotações/min) sob irrigação com solução salina a uma temperatura próxima de 20 °C com um motor elétrico cirúrgico com um contra-ângulo de redução de 20:1.
      NOTA: Apenas dois exercícios foram necessários.
   3. Comece com uma broca piloto de lança (Figura 4) a uma profundidade de 2,4 mm sob irrigação com solução salina.
      NOTA: Cada broca teve no máximo 10 usos.
   4. Como segunda broca, use (Figura 4) uma broca helicoidal a uma profundidade de 2.4 mm com um diâmetro de 1.6 mm sob solução salina.
      NOTA: Cada broca teve no máximo 10 usos.
3. Colocação de implantes
   1. Insira o implante com uma peça intermediária (Figura 5) presa ao contra-ângulo de redução 20:1.
   2. Antes de colocar o implante, limpe-o de qualquer esterilizante químico residual, girando-o no contra-ângulo com irrigação salina simultânea por 10 s (Figura 5).
   3. Colocar o implante de titânio (2 mm longitudinalmente e 1,8 mm de diâmetro) utilizando a peça intermédia a 20 rpm enquanto monitoriza o valor do binário em tempo real, registando o binário máximo de inserção.
      NOTA: Espera-se uma dificuldade inicial na inserção do implante devido à diferença entre a broca final e o implante, bem como o perfil cilíndrico do implante; No entanto, essa dificuldade inicial é rapidamente normalizada assim que o implante penetra na cortical inicial.
   4. Termine a inserção do implante antes que ele passe completamente pela cortical onde está inserido, ou seja, a face medial plana da tíbia.
      NOTA: No momento final da inserção do implante, é importante deixar o implante ligeiramente fora da cortical ou nivelado com a cortical onde está inserido, ou seja, a face medial plana da tíbia, para garantir a estabilidade primária (Figura 6).
4. Fechamento da ferida
   1. Suturar as bordas do tecido muscular com suturas internas simples usando uma sutura reabsorvível sintética monofilamentar 4/0 (Gliconato) (Figura 7).
   2. Realize o fechamento da pele com uma sutura intradérmica usando uma sutura reabsorvível sintética monofilamentar 4/0 (gliconato) (Figura 7).

4. Micro-tomografia computadorizada

1. Depois de concluir a cirurgia e ainda sob anestesia geral, faça uma microtomografia computadorizada para confirmar a colocação adequada do implante.
2. Remova o rato da cama de cirurgia e coloque-o na cama de digitalização. Localize a perna operada usando o modo de varredura ao vivo micro-CT e centralize o campo de visão no implante.
   NOTA: Os parâmetros de aquisição recomendados são Campo de visão de 5 mm, resolução espacial de 0,0001 mm³, 50 kV, 200 μA e tempo de aquisição de 3 min.
3. Uma vez adquirida a varredura, confirme a distância correta entre a face proximal do implante e a superfície do platô tibial, de acordo com o passo 5.2.1.
   NOTA: Este valor será útil para a padronização da técnica (Figura 8).

5. Cuidados pós-operatórios

1. Após a aquisição da imagem, retorne o rato à gaiola e monitore até a recuperação total.
   NOTA: Isso leva aproximadamente 5-10 min, dependendo do modelo animal. Espera-se que os ratos diabéticos permaneçam anestesiados por mais tempo e tenham um tempo de recuperação mais longo devido às alterações metabólicas associadas ao diabetes.
2. Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg) a cada 6-8 h e meloxicam (5 mg/kg) a cada 24 h, por via subcutânea, até 72 h.
3. Tempo de remoção da sutura
   1. Examine a ferida cirúrgica diariamente quanto a infecção, integridade da sutura ou outros problemas e remova os restos da sutura, se necessário, 15 dias após a cirurgia.

6. Eutanásia

1. Eutanasiar os animais usando uma câmara de CO₂ , de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health (NIH), com uma taxa de preenchimento de CO₂ de 30% a 70% do volume da câmara/min após o tempo de implantação (4 semanas ou 12 semanas).

7. Análise pós-cirúrgica

1. Para ambos os modelos (osteoporose e diabetes), remova a tíbia por desarticulação após a eutanásia para análise posterior.
   NOTA: Em relação à análise de micro-TC, os dados permitiram calcular o contato osso-implante (BIC). A aquisição da TC foi realizada utilizando os parâmetros descritos anteriormente, e a análise do BIC foi realizada dividindo-se a área óssea (mm²) pela área do implante (mm²) calculada na região cortical, adaptando-se a um protocolo já descrito na literatura¹⁸. Imagens representativas são mostradas para cada modelo, osteoporose (Figura 9) e diabetes (Figura 10).

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Resultados

Fase cirúrgica
É importante mencionar que ambos os modelos animais utilizados neste estudo apresentam certas restrições devido às doenças induzidas. Essas restrições quanto à manipulação de tecidos duros e moles são refletidas durante o procedimento cirúrgico.

No modelo diabético, o rato é maior, dificultando a estabilização das pernas durante os procedimentos cirúrgicos. Isso aumenta o tempo cirúrgico e, consequentemente...

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Discussão

Embora o rato seja um modelo amplamente utilizado para o estudo da osseointegração, é importante definir e descrever uma técnica cirúrgica reprodutível para a colocação adequada de implantes. Tal técnica poderia servir de guia para a comunidade científica. Além disso, o fato de certas doenças, como osteoporose e diabetes, alterarem o metabolismo ósseo implica em demandas mais fortes para o planejamento correto de procedimentos cirúrgicos. O rato se compara favoravelmente co...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G needles+A2:C30	Terumo	NN-2238R
4/0 monofilament synthetic resorbable suture	Braun ( MonoSyn)
5 mL, 10 mL syringes	Braun	4617100V-02 4606051V
Adson forceps	Antão Medical	Ref: A586
BBDR ( Biobreeding Diabetes Resistant ) Sprague Dawley Rats	Janvier Labs
Betadine	Mylan
Buprecare	Animalcare (UK)
Castroviejo Caliper 0-40 mm 15 cm angled	UL AMIN Industries
Castroviejo Needle Holder	Antão Medical	Ref: AM1702
Dental surgery scissors curved and straight	Antão Medical	AMA603 / AMA600
Electric shaver	Oster Pro 3000i	34264482227
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T	Ref: 11150-10
Gauze pads	COVIDIEN	441001
Glucometer	Menarini (Italy)
Helicoidal Drill / OSTEO-PIN DRILL Ø1.6 mm	soadco	Ref. OS-8001
Implants / SCREW OSTEO-PIN Ø1.8 x 2.0 mm	soadco	Ref. OS-3
Isoflo	Le Vet Pharma (Netherlands)
Lance pilot drill / Lanceolate Drill (DS)	soadco	Ref. 10 02 01 T
Latex gloves - Surgical gloves sterile	Hartmann	Ref: 9426495
Lucas Surgical Curette	Antão Medical	Ref: AMA940-3
Metacam	Boehringer Ingelheim(Germany)
Micro forceps straight	nopa	Ref: AB 542/12
Micro-CT scan( Quantum Fx microCT )	Perkin Elmer (US)
Osteoporotic Sprague Dawley females Rats	Janvier Labs
Periosteal elevator -  Molt 2-4	Antão Medical	Ref: A1564
Physiologic solution for Irrigation	Hygitech	Ref:10238
Scalpel Blade Carbon Steel 15C	Razor Med	Ref: 02846
Sterile Gauze Swabs	Alledental	Ref: 270712
Sterile Irrigation system	Hygitech	Ref:HY1-110001D
Sterile towels (1 piece per animal)	Dinarex	4410
Surgical contra-angle handpiece	W&H	Ref: WS-75 LED G
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 08877
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 01309
Surgical Electric Motor	WH Implantmed Type: SI-1023	Ref: 30288000
Surgical scalpel handle	AsaDental	Ref: 0350-3
Towel clamps	Xelpov surgical	AF-773-11
Ultrasonic device	J.P. Selecta, Abrera, Spain