당뇨병 및 골다공증의 쥐 경골 모델을 위한 외과적 뼈 이식 기술

요약

쥐 모델에 임플란트를 배치하는 것은 임상 연구에 필수적인 실험 절차입니다. 이 연구는 당뇨병 및 골다공증이 있는 쥐 모델의 경골에 티타늄 임플란트를 이식하기 위한 포괄적인 수술 프로토콜을 제시합니다.

초록

쥐는 오랫동안 임플란트 치과 및 정형외과, 특히 생체 재료와 뼈 조직 간의 상호 작용을 연구하는 데 귀중한 동물 모델로 사용되어 왔습니다. 쥐의 경골은 얇은 조직층(피부와 근육)을 통해 외과적으로 쉽게 접근할 수 있고 내측 얼굴의 평평한 모양으로 인해 골내 장치의 외과적 삽입을 용이하게 하기 때문에 자주 선택됩니다. 또한 이 모델을 사용하면 다양한 임상 조건을 모방하여 특정 질병을 유도하여 기하학적 구조, 표면 질감 또는 생물학적 단서와 같은 다양한 임플란트 조건에 대한 생물학적 반응을 평가할 수 있습니다. 그러나 견고한 대뇌 피질 구조에도 불구하고 특정 골내 장치는 성공적인 이식을 위해 디자인과 크기에 대한 조정이 필요할 수 있습니다. 따라서 임플란트 부위의 연조직과 경조직을 모두 조작하기 위한 표준화된 수술 방법을 확립하는 것은 특히 임플란트 치과 및 정형외과와 같은 분야에서 적절한 임플란트 또는 나사 장치 배치를 보장하는 데 필수적입니다. 이 연구에는 80마리의 Sprague Dawley 쥐가 포함되었으며, 각각의 질병에 따라 골다공증이 있는 그룹 1과 제2형 당뇨병이 있는 그룹 2로 나뉩니다. 이식은 4주와 12주에 이루어졌으며, 동일한 외과의가 일관된 수술 기법을 따랐습니다. 긍정적인 생물학적 반응이 관찰되었으며, 이는 식립된 모든 임플란트의 완전한 골유착을 나타냅니다. 이러한 결과는 수술 프로토콜의 성공을 입증하며, 이는 다른 연구에도 복제될 수 있으며 생체 재료 커뮤니티의 벤치마크 역할을 할 수 있습니다. 특히, 골유착 값은 두 질환 모델 모두에서 4주와 12주 모두에서 안정적으로 유지되었으며, 이는 시간이 지남에 따라 임플란트의 지속적인 통합을 보여주고 빠르면 4주에 긴밀한 뼈 연결 확립을 강조합니다.

서문

쥐를 실험 대상으로 선택하는 일반적인 이유는 번식이 쉽고 대형 동물 모델에 비해 상대적으로 저렴하기 때문입니다. 예를 들어, 골다공증 또는 당뇨병과 같은 질환의 신뢰할 수 있는 재현과 같은 새로운 절차의 출현으로 인해 이 모델은 약물 및 수술 장치 또는 절차에 대한 생물학적 반응에서 치료법의 잠재적 사용 및/또는 질병의 영향을 분석하는 데 특히 유용합니다 ^1,2.

쥐의 골량 증가는 대부분 생후 첫 6개월 동안 발생하지만, 일부 연구자들은 긴 뼈가 적어도 1년 동안 지속적으로 성장하며 길이가 점진적으로 증가한다고 믿습니다¹. 노화가 진행됨에 따라 모델링에서 리모델링으로의 전환이 이루어지는데, 이는 모든 경우에 뼈 전체에서 동일하게 발생하지는 않는다². 암컷 Sprague Dawley 쥐는 수컷 쥐보다 천천히 성장하고 수컷 쥐보다 체중이 더 적습니다¹. 쥐의 지속적인 뼈 신장과 다양한 뼈 리모델링 역학은 인간의 건강 문제를 다룰 때 고려해야 하는 요소입니다. 그러나 쥐의 뼈가 평생 발달한다거나 1번 뼈를 개조할 수 없다는 것을 보여주는 실험적 연구는 아직 찾을 수 없었다. 실험이 생후 10개월쯤에 시작되는 경우, 이러한 종방향 뼈 성장으로 인해 경골의 성장판에서 최소 1mm의 여백은 그대로 유지되어야 하며, 이는 치과 임플란트 연구에서 고려해야 할 문제이다². 호르몬은 또한 뼈 연구의 핵심 매개 변수인데, 생후 8개월에 수컷 쥐는 암컷보다 경골의 뼈 너비가 22% 더 크고 파괴 강도가 33% 더 큰 것으로 밝혀졌기 때문입니다³.

따라서 정형외과 나사 또는 치과 임플란트의 골유착은 뼈에 장치 이식에 대한 전신 반응에 영향을 미치는 수많은 요인에 의존하는 복잡한 과정이기 때문에 장애의 신뢰할 수 있는 재현은 정형외과 및 임플란트 치과에서 매우 중요합니다. 골다공증 및 당뇨병과 같은 전신 질환은 정형외과 및 임플란트 치과 치료의 성공률에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으므로 쥐 모델에서 이러한 질환을 안정적으로 재현하는 것을 적용하여 이러한 한계를 극복하는 방법을 모색할 수 있습니다.

쥐 경골은 수술적 접근이 용이하고 골의 부피가 적당하며 내측판의 평평한 모양으로 인해 외과적 골 이식 실험에 적합하며^4,5 임플란트 표면이 골유착에 미치는 영향을 탐구하는 수많은 연구에서 사용되어 왔습니다 ^4,5,6. 점점 더 많은 연구가^{건강한 동물7}과 당뇨병 또는 골다공증의 영향을 받은 손상된 동물 모두에서 임플란트 표면에 첨가된 코팅 및 물질의 골유착에 미치는 영향을 평가하고 있다 ^{8,9,10,11,12,13,14}.

쥐 한 마리의 경골에 삽입되는 임플란트 장치의 수는 제한되어 있으며 연구 유형에 따라 다를 수 있습니다. 임플란트의 수나 연구 조건에 따라 장치의 치수는 외과적 외상을 최소화할 수 있도록 조정되어야 합니다. 하나의 임플란트에 대한 연구에서는 거의 인간 크기의 임플란트 (직경 2.0mm, 길이 4-5mm)를 배치 할 수 있으며 이중 피질 고정을 달성 할 수 있습니다 6,7,15,16. 다중 임플란트 프로토콜에서 임플란트의 치수는 적절한 임플란트 크기(직경 1.5mm, 길이 2.5mm)를 채택해야 합니다^4,17.

본 연구는 골다공증 및 당뇨병 쥐 모델의 두 쥐 모델의 경골에 티타늄 임플란트를 배치하기 위한 표준화된 수술 프로토콜을 설명하는 것을 목표로 합니다. 또한, 이 연구를 통해 다양한 유형의 임플란트 표면 생체 기능화와 골유착에 미치는 영향을 평가하기 위해 수술 프로토콜을 테스트할 수 있습니다.

80마리의 쥐 표본을 두 그룹으로 나눴다. 그룹 1에서는 난소 절제술을 받은 Sprague Dawley 암컷 40마리와 가짜 동물 5마리를 선택했으며, 평균 체중은 484g이고 평균 연령은 12주였습니다. 공급업체의 권장 사항( 재료 표 참조)에 따라 중성화 수술 후 3개월 후에 실험이 시작되었습니다. 이 대기 기간은 성 호르몬의 소멸을 보장했다. 수술 당시 마이크로 컴퓨터 단층촬영(micro-CT) 뼈 분석을 통해 골다공증이 확인되었는데, 그 결과 가짜 그룹에 비해 평균 20%의 골 손실이 확인되었습니다. 그룹 2는 제2형 당뇨병을 앓고 있는 40마리의 BBDR(Bio Breeding Diabetes Resistant) 유전자 변형 Sprague Dawley 쥐로 구성되었습니다. 평균 체중은 730g, 평균 연령은 12주였다. 수술 전, 3일 연속 혈당 측정으로 당뇨병 상태를 확인했으며 결과는 200mg/dL 이상이었습니다. 공복 6시간 동안 혈당계로 포도당을 측정하고, 꼬리 구멍을 뚫어 혈액 방울을 채취했습니다.

길이 2mm, 직경 1.8mm의 3등급 티타늄 임플란트가 사용되었습니다. 모든 임플란트는 초음파 수조(230VAC, 50/60Hz, 360W)를 사용하여 시클로헥산(2분간 3회), 아세톤(1분간 1회), 탈이온수(2분간 3회), 에탄올(2분간 3회)로 초음파로 세척하여 클린룸 조건에서 멸균했습니다. 그런 다음 샘플을 질소 가스로 건조시키고 0.5bar의 질소 빔을 샘플에 직접 적용했습니다. 이식하기 전에 임플란트를 먼저 탈이온수에 담근 다음 70% 에탄올(v/v)에 10분 동안 담갔습니다. 그 후, 임플란트는 멸균 마이크로 원심분리기 튜브로 옮겨졌고 수술 전까지 멸균 상태로 유지되었습니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 스페인 법률(Royal Decree 53/2013) 및 Generalitat de Catalunya 규정(Decree 214/97)에 따라 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호를 위한 유럽 공동체 지침(Directive 2010/63/EU)에 따라 수행되었습니다. 모든 동물 시술 및 취급에 대한 윤리 승인은 Vall D'Hebron Institut de Recerca(등록 번호 72/18 CEEA)의 동물 실험 윤리 위원회로부터 획득했습니다. 골다공증 모델의 경우, 평균 체중이 484g이고 평균 연령이 12주인 암컷 Sprague Dawley 쥐가 사용되었습니다. 당뇨병 모델의 경우, 평균 체중 730g, 평균 연령 12주의 유전자 변형 암컷 BBDR(Bio Breeding Diabetes Resistant) 랫트를 사용하였다. 모든 동물은 상업 공급 업체에서 공급되었습니다. 연구에 사용된 동물, 시약 및 장비의 구체적인 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 동물의 마취/약리학 및 준비

1. 수술 시작 10-15분 전에 피하 주사를 통해 부프레노르핀 0.05mg/kg, 멜록시캄 2mg/kg을 사용하여 수술 전 진통을 투여합니다.
2. 흡입 이소플루란으로 수술 중 마취 수행: 유도 중 신선한 공기에서 5%에서 시작하고 3%로 유지합니다. 쥐의 방에서 마취를 유도하고 수술 중 원뿔형 코 적응으로 이소플루란 공급을 유지합니다.

2. 수술 준비

1. 직장 프로브로 마취된 동물의 체온을 측정하고 수술 절차 전반에 걸쳐 열 지원을 위해 전자 제어 가열 패드를 사용합니다. 각막 건조를 피하기 위해 수술 시작 전에 눈 연고를 발라야 합니다.
   참고: 필요한 경우 눈 건조 상태를 확인한 후 연고를 다시 발라야 합니다.
2. 전기 면도기로 머리를 다듬고 제모 크림을 바르면 남아 있는 털을 제거합니다.
3. 멸균 면봉을 사용하여 요오드와 70%(v/v) 에탄올의 패턴으로 무릎 피부를 안쪽에서 시작하여 절개 라인의 바깥쪽으로 재추적하지 않고 이동하여 무균 수술 필드를 얻습니다. 최소 3회 연속 청소(요오드-에탄올-요오드)를 수행합니다.
4. 동물 위에 멸균 창호 수술용 드레이프를 배치하여 수술 부위를 격리하고 중앙 개구부를 통해 다리를 노출시킵니다(그림 1).

3. 수술

1. 외과적 노출
   1. 뼈를 노출시키기 위해 형이상학 영역에서 경골 전방 내측면의 근위 경계를 따라 수직으로 약 1cm 길이의 전체 피부 절개를 합니다(그림 2).
   2. 다리를 안정시키고 절개를 하는 동안 피부를 아래 뼈에 팽팽하게 당겨 깨끗한 절개가 올바른 위치에 유지되도록 합니다. 식염수에 적신 찜질로 예상되는 빛 출혈을 청소하여 관리합니다(그림 2).
      참고: 쥐 피부는 얇고 처지거나 헐거워집니다. 피부의 안정화는 매우 중요하고 필요합니다.
   3. 작은 골막 엘리베이터를 사용하여 뼈에서 조직을 완전히 분리합니다(그림 3).
   4. 경골 내측 측면의 후방 경계에 있는 경골 두개근(tibialis cranialis muscle), gracilis, 비복근(gastrocnemius lateral head muscle)의 삽입이 확인될 때까지 뼈를 노출시키며, 이는 뼈에 단단히 부착된 섬유질 백색 조직입니다(그림 3).
      참고: 쥐의 크기에 관계없이 전체 샘플에서 유사한 특성과 자극을 가진 뼈 영역에 임플란트를 배치할 수 있도록 이 근육 삽입 그룹을 식별하는 것이 중요합니다.
2. 드릴링 공정
   1. 근위 경골 능선과 경골 내측면의 후방 한계 사이의 올바른 영역에서 드릴링 과정을 시작하여 경골 두개근, 경사 근 및 비복근 외측 머리 근육의 삽입에 인접 해 있습니다.1
      알림: 올바른 위치는 경골 고원에서 5mm ± 2mm여야 합니다.
   2. 20:1 감소 반대 각도의 수술용 전기 모터를 사용하여 20°C에 가까운 온도에서 식염수 세척 하에 최대 150rpm(회전/분)으로 드릴링합니다.
      참고: 두 번의 훈련만 필요했습니다.
   3. 식염수 관개 아래 2.4mm 깊이에서 랜스 파일럿 드릴(그림 4)로 시작합니다.
      알림: 각 드릴은 최대 10회 사용할 수 있습니다.
   4. 두 번째 드릴로 2.4mm 깊이의 식염수 아래 1.6mm 직경의 트위스트 설계 드릴(그림 4)을 사용합니다.
      알림: 각 드릴은 최대 10회 사용할 수 있습니다.
3. 임플란트 식립
   1. 20:1 reduction contra-angle에 부착된 중간 조각(그림 5)과 함께 임플란트를 삽입합니다.
   2. 임플란트를 식립하기 전에 임플란트를 10초 동안 식염수 세척과 동시에 반대 각도로 회전시켜 잔류 화학 멸균제로부터 임플란트를 청소합니다(그림 5).
   3. 중간 피스를 사용하여 티타늄 임플란트(길이 2mm, 지름 1.8mm)를 20rpm으로 배치하면서 실시간 토크 값을 모니터링하여 최대 삽입 토크를 등록합니다.
      참고: 임플란트 삽입의 초기 어려움은 최종 드릴과 임플란트의 차이와 임플란트의 원통형 프로파일로 인해 예상됩니다. 그러나 이러한 초기의 어려움은 임플란트가 초기 피질골을 관통하자마자 빠르게 정상화됩니다.
   4. 임플란트가 삽입된 피질골, 즉 경골의 평평한 내측면을 완전히 통과하기 전에 임플란트 삽입을 완료합니다.
      참고: 임플란트 삽입의 마지막 순간에는 임플란트를 피질뼈에서 약간 바깥쪽에 두거나 임플란트가 삽입된 피질골, 즉 경골의 평평한 내측면과 수평을 이루는 것이 중요합니다(그림 6).
4. 상처 봉합
   1. 4/0 모노필라멘트 합성 흡수성 봉합사(글리코네이트)를 사용하여 간단한 내부 봉합사로 근육 조직 경계를 봉합합니다(그림 7).
   2. 4/0 모노필라멘트 합성 흡수성 봉합사(글리코네이트)를 사용하여 피내 봉합사로 피부 봉합을 수행합니다(그림 7).

4. 마이크로 CT 스캔

1. 수술을 마친 후 전신 마취 상태에서 마이크로 CT 스캔을 실시하여 임플란트가 적절하게 배치되었는지 확인합니다.
2. 수술 침대에서 쥐를 꺼내 스캐닝 침대에 놓습니다. micro-CT 라이브 스캔 모드를 사용하여 수술한 다리를 찾고 임플란트의 시야를 중앙에 놓습니다.
   참고: 권장되는 획득 매개변수는 시야각 5mm, 공간 분해능 0.0001mm³, 50kV, 200μA 및 획득 시간 3분입니다.
3. 스캔이 획득되면 5.2.1단계에 따라 임플란트의 근위 측면과 경골 고원 표면 사이의 정확한 거리를 확인합니다.
   참고: 이 값은 기술의 표준화에 도움이 됩니다(그림 8).

5. 수술 후 관리

1. 이미징 획득 후 쥐를 케이지로 돌려보내고 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다.
   참고: 동물 모델에 따라 약 5-10분 정도 소요됩니다. 당뇨병이 있는 쥐는 당뇨병과 관련된 대사 변화로 인해 더 오래 마취된 상태로 유지되고 회복 시간이 더 길어질 것으로 예상됩니다.
2. 6-8시간마다 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 투여하고 24시간마다 멜록시캄(5mg/kg)을 최대 72시간까지 피하로 투여합니다.
3. 봉합사 제거 시간
   1. 수술 상처의 감염, 봉합 무결성 또는 기타 문제가 있는지 매일 검사하고 필요한 경우 수술 후 15일 이내에 봉합사 잔여물을 제거합니다.

6. 안락사

1. 미국 국립보건원(NIH) 지침에 따라 이식 시간(4주 또는 12주) 후 챔버 부피/분의 30%-70%의 CO₂ 충전률로 CO₂ 챔버를 사용하여 동물을 안락사시킵니다.

7. 수술 후 분석

1. 두 모델(골다공증 및 당뇨병) 모두에 대해 추가 분석을 위해 안락사 후 관절 분리를 통해 경골을 제거합니다.
   참고: 마이크로 CT 분석과 관련하여 뼈-임플란트 접촉(BIC)을 계산할 수 있는 데이터가 허용되었습니다. CT 촬영은 앞서 설명한 파라미터를 이용하여 수행하였고, BIC 분석은 피질 영역에서 계산된 뼈 면적(^mm2)을 임플란트 면적(^mm2)으로 나누어 수행하였으며, 이는 문헌¹⁸에 이미 기술된 프로토콜을 적용하였다. 골다공증(그림 9) 및 당뇨병(그림 10)에 대한 대표 이미지가 각 모델에 대해 표시됩니다.

결과

수술 단계
이 연구에 사용된 두 동물 모델 모두 유발된 질병으로 인해 특정 제약이 있다는 점을 언급하는 것이 중요합니다. 경조직과 연조직의 조작에 대한 이러한 제약은 수술 과정에서 반영됩니다.

당뇨병 모델에서는 쥐가 더 커서 수술 중에 다리를 안정시키기가 어렵습니다. 이로 인해 수술 시간이 길어지고 결과적으로 마취 시간이...

토론

쥐는 골유착을 연구하는 데 널리 사용되는 모델이지만, 임플란트를 적절하게 배치하기 위한 재현 가능한 수술 기법을 정의하고 설명하는 것이 중요합니다. 이러한 기술은 과학계의 지침이 될 수 있습니다. 더욱이, 골다공증 및 당뇨병과 같은 특정 질병이 뼈 대사를 변화시킨다는 사실은 수술 절차를 올바르게 설계해야 한다는 더 강력한 요구를 의미합니다. 이 쥐는 골다?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G needles+A2:C30	Terumo	NN-2238R
4/0 monofilament synthetic resorbable suture	Braun ( MonoSyn)
5 mL, 10 mL syringes	Braun	4617100V-02 4606051V
Adson forceps	Antão Medical	Ref: A586
BBDR ( Biobreeding Diabetes Resistant ) Sprague Dawley Rats	Janvier Labs
Betadine	Mylan
Buprecare	Animalcare (UK)
Castroviejo Caliper 0-40 mm 15 cm angled	UL AMIN Industries
Castroviejo Needle Holder	Antão Medical	Ref: AM1702
Dental surgery scissors curved and straight	Antão Medical	AMA603 / AMA600
Electric shaver	Oster Pro 3000i	34264482227
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T	Ref: 11150-10
Gauze pads	COVIDIEN	441001
Glucometer	Menarini (Italy)
Helicoidal Drill / OSTEO-PIN DRILL Ø1.6 mm	soadco	Ref. OS-8001
Implants / SCREW OSTEO-PIN Ø1.8 x 2.0 mm	soadco	Ref. OS-3
Isoflo	Le Vet Pharma (Netherlands)
Lance pilot drill / Lanceolate Drill (DS)	soadco	Ref. 10 02 01 T
Latex gloves - Surgical gloves sterile	Hartmann	Ref: 9426495
Lucas Surgical Curette	Antão Medical	Ref: AMA940-3
Metacam	Boehringer Ingelheim(Germany)
Micro forceps straight	nopa	Ref: AB 542/12
Micro-CT scan( Quantum Fx microCT )	Perkin Elmer (US)
Osteoporotic Sprague Dawley females Rats	Janvier Labs
Periosteal elevator -  Molt 2-4	Antão Medical	Ref: A1564
Physiologic solution for Irrigation	Hygitech	Ref:10238
Scalpel Blade Carbon Steel 15C	Razor Med	Ref: 02846
Sterile Gauze Swabs	Alledental	Ref: 270712
Sterile Irrigation system	Hygitech	Ref:HY1-110001D
Sterile towels (1 piece per animal)	Dinarex	4410
Surgical contra-angle handpiece	W&H	Ref: WS-75 LED G
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 08877
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 01309
Surgical Electric Motor	WH Implantmed Type: SI-1023	Ref: 30288000
Surgical scalpel handle	AsaDental	Ref: 0350-3
Towel clamps	Xelpov surgical	AF-773-11
Ultrasonic device	J.P. Selecta, Abrera, Spain