Técnica quirúrgica de implante óseo para modelos de tibia de rata de diabetes y osteoporosis

Resumen

La colocación de implantes en un modelo de rata es un procedimiento experimental esencial para la investigación clínica. Este estudio presenta un protocolo quirúrgico completo para implantar implantes de titanio en la tibia de modelos de ratas con diabetes y osteoporosis.

Resumen

La rata ha servido durante mucho tiempo como un valioso modelo animal en implantología y ortopedia, particularmente en el estudio de las interacciones entre los biomateriales y el tejido óseo. La tibia de la rata es frecuentemente elegida debido a su fácil acceso quirúrgico a través de finas capas de tejido (piel y músculo) y la forma aplanada de su cara medial, lo que facilita la inserción quirúrgica de dispositivos intraóseos. Además, este modelo permite la inducción de enfermedades específicas, imitando diversas condiciones clínicas para evaluar las respuestas biológicas a diferentes condiciones del implante, como la geometría, la textura de la superficie o las señales biológicas. Sin embargo, a pesar de su robusta estructura cortical, ciertos dispositivos intraóseos pueden requerir adaptaciones en el diseño y el tamaño para una implantación exitosa. Por lo tanto, el establecimiento de métodos quirúrgicos estandarizados para la manipulación de tejidos blandos y duros en la región de implantación es esencial para garantizar la colocación adecuada del implante o del dispositivo de tornillo, especialmente en campos como la odontología de implantes y la ortopedia. Este estudio incluyó ochenta ratas Sprague Dawley divididas en dos grupos en función de sus respectivas enfermedades: Grupo 1 con osteoporosis y Grupo 2 con diabetes tipo 2. Los implantes se realizaron a las 4 semanas y a las 12 semanas, con el mismo cirujano siguiendo una técnica quirúrgica consistente. Se observó una respuesta biológica positiva, lo que indica una osteointegración completa de todos los implantes colocados. Estos resultados validan el éxito del protocolo quirúrgico, que puede ser replicado para otros estudios y servir de referencia para la comunidad de biomateriales. En particular, los valores de osteointegración se mantuvieron estables tanto a las 4 semanas como a las 12 semanas para ambos modelos de enfermedad, lo que demuestra una integración duradera del implante a lo largo del tiempo y enfatiza el establecimiento de una conexión ósea íntima ya a las 4 semanas.

Introducción

La elección común de ratas como sujetos experimentales se debe al hecho de que son fáciles de criar y relativamente baratas en comparación con los modelos animales más grandes. La aparición de nuevos procedimientos, como la reproducción fiable de un trastorno, por ejemplo, la osteoporosis o la diabetes, hace que este modelo sea especialmente útil para analizar el uso potencial de tratamientos y/o la influencia de la enfermedad en la respuesta biológica a fármacos y dispositivos quirúrgicos o procedimientos ^1,2.

El aumento de masa ósea de la rata se produce principalmente durante los primeros 6 meses de vida, aunque algunos investigadores creen que el hueso largo crece constantemente durante al menos un año con un aumento progresivo de la longitud¹. Con el envejecimiento, se produce una transición del modelado a la remodelación, que no ocurre en todos los casos por igual en todo el esqueleto². Las ratas Sprague Dawley hembras crecen más lentamente que las ratas macho y alcanzan un pico de peso más bajo^{que las} ratas macho. La elongación ósea continua y la dinámica variada de remodelación ósea en ratas son factores que deben tenerse en cuenta al abordar los problemas de salud humana; Sin embargo, aún no ha sido posible encontrar ninguna investigación experimental que demuestre el desarrollo del hueso de rata de por vida o la incapacidad de la especie para remodelar^{el hueso}. Si la experimentación comienza alrededor de los 10 meses de edad, se debe dejar intacto un margen de al menos 1 mm de la placa de crecimiento de la tibia debido a este crecimiento óseo longitudinal, una cuestión a considerar en los estudios de implantes dentales². Las hormonas también son un parámetro clave en la investigación ósea, ya que a los 8 meses de edad, se encontró que las ratas macho tenían un 22% más de ancho óseo y un 33% más de resistencia a la rotura que las hembras en la tibia³.

Por lo tanto, la reproducción fiable de un trastorno es muy importante en ortopedia e implantología dental, ya que la osteointegración de un tornillo ortopédico o un implante dental es un proceso complejo que depende de numerosos factores que influyen en la respuesta sistémica a la implantación del dispositivo en el hueso. Se sabe que los trastornos sistémicos como la osteoporosis y la diabetes afectan la tasa de éxito en ortopedia e implantología dental, por lo que la reproducción confiable de esos trastornos en modelos de ratas se puede aplicar para explorar formas de superar estas limitaciones.

La tibia de rata, debido al fácil acceso quirúrgico, el volumen óseo moderado y la forma plana en la placa medial, la hace adecuada para experimentos quirúrgicos de implante óseo ^4,5, y se ha utilizado en numerosos estudios de investigación que exploran los efectos de la superficie del implante en la osteointegración ^4,5,6. Cada vez son más los estudios que evalúan los efectos sobre la osteointegración de los recubrimientos y sustancias añadidos a la superficie del implante tanto^{en animales sanos} 7 como en animales comprometidos afectados por diabetes u osteoporosis ^{8,9,10,11,12,13,14}.

El número de dispositivos de implante colocados en la tibia de una rata es limitado y puede diferir según el tipo de estudio. Dependiendo del número de implantes o de las condiciones del estudio, las dimensiones de los dispositivos deben adaptarse para minimizar el trauma quirúrgico. En estudios con un implante, se puede colocar un implante de tamaño casi humano (2,0 mm de diámetro y 4 a 5 mm de longitud) y se puede lograr un anclaje bicortical 6,7,15,16. Las dimensiones de los implantes en los protocolos multiimplante deben adoptar un tamaño de implante adecuado (1,5 mm de diámetro y 2,5 mm de longitud)^4,17.

El presente estudio tiene como objetivo describir un protocolo quirúrgico estandarizado para la colocación de implantes de titanio en la tibia de dos modelos de rata: el modelo de rata con osteoporosis y el modelo de rata diabética. Además, este estudio permite probar el protocolo quirúrgico para evaluar diferentes tipos de biofuncionalización de la superficie del implante y su efecto sobre la osteointegración.

Una muestra de 80 ratas se dividió en dos grupos. En el grupo 1 se seleccionaron 40 hembras Sprague Dawley ovariectomizadas y 5 animales simulados, con un peso medio de 484 g y una edad media de 12 semanas. Sobre la base de las recomendaciones de los proveedores (véase la Tabla de Materiales), tres meses después de la castración, comenzó el experimento. Este período de espera aseguró la desaparición de las hormonas sexuales. La osteoporosis se confirmó en el momento de la cirugía mediante el análisis óseo de microtomografía computarizada (micro-TC), que reflejó una pérdida ósea promedio del 20% en comparación con el grupo simulado. El grupo 2 consistió en 40 ratas Sprague Dawley modificadas genéticamente BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) con diabetes tipo II. El peso medio fue de 730 g y la edad media fue de 12 semanas. Antes de la cirugía, el estado diabético se confirmó con tres días consecutivos de mediciones de glucosa con resultados superiores a 200 mg/dL. La glucosa se midió con un glucómetro en 6 h de ayuno, y se recogió una gota de sangre mediante punción de cola.

Se utilizaron implantes de titanio de grado 3 de 2 mm de longitud y 1,8 mm de diámetro. Todos los implantes se esterilizaron en condiciones de sala limpia, mediante limpieza ultrasónica en ciclohexano (3 veces durante 2 minutos), acetona (una vez durante 1 minuto), agua desionizada (3 veces durante 2 minutos), etanol (3 veces durante 2 minutos) y acetona (3 veces durante 2 minutos) utilizando un baño de ultrasonidos (230 VCA, 50/60 Hz, 360 W). A continuación, las muestras se secaron con gas nitrógeno y se aplicó un haz de nitrógeno a 0,5 bar directamente sobre las muestras. Antes de la implantación, los implantes se remojaron primero en agua desionizada y luego se sumergieron en etanol al 70% (v/v) durante 10 min. Después de esto, los implantes se transfirieron a tubos de microcentrífuga estériles y se mantuvieron en condiciones estériles hasta la cirugía.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices de la Comunidad Europea para la protección de los animales utilizados con fines científicos (Directiva 2010/63/UE) implementadas en la legislación española (Real Decreto 53/2013) y la normativa de la Generalitat de Catalunya (Decreto 214/97). El Comité Ético de Experimentación Animal del Vall D'Hebron Institut de Recerca (número de registro 72/18 CEEA) ha obtenido la aprobación ética de todos los procedimientos y manipulaciones de los animales. Para el modelo osteoporótico se utilizaron ratas hembras Sprague Dawley con un peso promedio de 484 g y una edad promedio de 12 semanas. En cuanto al modelo diabético, se emplearon ratas hembras modificadas genéticamente BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) con un peso promedio de 730 g y una edad promedio de 12 semanas. Todos los animales procedían de un proveedor comercial. Los detalles específicos de los animales, reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Anestesia/farmacología y preparación de animales

1. Administrar analgesia prequirúrgica con buprenorfina a 0,05 mg/kg y meloxicam a 2 mg/kg mediante inyecciones subcutáneas 10-15 min antes de iniciar el procedimiento quirúrgico.
2. Realizar anestesia intraquirúrgica con isoflurano inhalado: iniciar al 5% al aire libre durante la inducción y mantener al 3%. Inducir la anestesia en una cámara de ratas y mantener el suministro de isoflurano con una adaptación cónica de la nariz durante la cirugía.

2. Preparación para la cirugía

1. Mida la temperatura corporal del animal anestesiado con una sonda rectal y use una almohadilla térmica controlada electrónicamente para soporte térmico durante todo el procedimiento quirúrgico. El ungüento para los ojos debe aplicarse antes del inicio de la cirugía para evitar la sequedad de la córnea.
   NOTA: Si es necesario, se debe volver a aplicar la pomada después de verificar la sequedad ocular.
2. Recorta el vello con una afeitadora eléctrica y aplica crema depilatoria para eliminar los restos de pelo.
3. Obtenga un campo quirúrgico aséptico limpiando la piel de la rodilla con un patrón de yodo y etanol al 70% (v/v) utilizando hisopos estériles, comenzando desde el interior y moviéndose hacia afuera de la línea de incisión sin volver a trazar. Realizar un mínimo de tres rotaciones consecutivas de limpieza (yodo-etanol-yodo).
4. Aísle el campo operatorio colocando un paño quirúrgico fenestrado estéril sobre el animal, exponiendo la pata a través de la abertura central (Figura 1).

3. Cirugía

1. Exposición quirúrgica
   1. Realizar una incisión cutánea de espesor completo de aproximadamente 1 cm de longitud verticalmente a lo largo del borde proximal de la cara anteromedial de la tibia, en la región de la metáfisis para exponer el hueso (Figura 2).
   2. Estabilice la pierna y tense la piel contra el hueso subyacente mientras realiza la incisión, asegurándose de que una incisión limpia permanezca en el lugar correcto. Para controlarlo, limpie el sangrado leve esperado con una compresa empapada en solución salina (Figura 2).
      NOTA: La piel de la rata es delgada y está flácida o suelta. La estabilización de la piel es crucial y necesaria.
   3. Separar completamente el tejido del hueso utilizando pequeños elevadores periósticos (Figura 3).
   4. Exponer el hueso hasta identificar la inserción del músculo tibial craneal, el gracilis y el músculo gastrocnemio lateral de la cabeza en el borde posterior de la cara medial de la tibia, como un tejido blanco fibroso firmemente adherido al hueso (Figura 3).
      NOTA: Es importante identificar este grupo de inserciones musculares para permitir la colocación del implante en una región ósea con características y estímulos similares en toda la muestra, independientemente del tamaño de la rata.
2. Proceso de perforación
   1. Comenzar el proceso de perforación en la región correcta entre la cresta tibial proximal y el límite posterior de la cara medial del hueso tibia, contiguo a la inserción del músculo tibial craneal, el gracilis y el músculo lateral de la cabeza gastrocnemio, evitando cualquier lesión muscular.1
      NOTA: La ubicación correcta debe estar a 5 mm ± 2 mm de la meseta tibial.
   2. Taladre con un máximo de 150 rpm (rotaciones/min) bajo riego con solución salina a una temperatura cercana a 20 °C con un motor eléctrico quirúrgico con un contra-ángulo de reducción de 20:1.
      NOTA: Solo se requirieron dos simulacros.
   3. Comience con un taladro piloto de lanza (Figura 4) a una profundidad de 2,4 mm bajo irrigación con solución salina.
      NOTA: Cada taladro tenía un máximo de 10 usos.
   4. Como segundo taladro, utilice (Figura 4) un taladro de diseño helicoidal a una profundidad de 2,4 mm con un diámetro de 1,6 mm bajo solución salina.
      NOTA: Cada taladro tenía un máximo de 10 usos.
3. Colocación de implantes
   1. Inserte el implante con una pieza intermedia (Figura 5) unida al contra-ángulo de reducción 20:1.
   2. Antes de colocar el implante, limpie el implante de cualquier residuo de esterilizante químico girándolo en el contra-ángulo con irrigación salina simultánea durante 10 s (Figura 5).
   3. Coloque el implante de titanio (2 mm de longitud y 1,8 mm de diámetro) utilizando la pieza intermedia a 20 rpm mientras controla el valor del par en tiempo real, registrando el par máximo de inserción.
      NOTA: Se espera una dificultad inicial en la inserción del implante debido a la diferencia entre la fresa final y el implante, así como al perfil cilíndrico del implante; Sin embargo, esta dificultad inicial se normaliza rápidamente tan pronto como el implante penetra en el hueso cortical inicial.
   4. Termine la inserción del implante antes de que pase completamente por el hueso cortical donde se inserta, es decir, la cara medial plana de la tibia.
      NOTA: En el momento final de la inserción del implante, es importante dejar el implante ligeramente fuera del hueso cortical o al nivel del hueso cortical donde se inserta, es decir, la cara medial plana de la tibia, para asegurar la estabilidad primaria (Figura 6).
4. Cierre de heridas
   1. Suturar los bordes del tejido muscular con suturas internas simples utilizando una sutura reabsorbible sintética monofilamento 4/0 (Gliconato) (Figura 7).
   2. Realizar el cierre cutáneo con una sutura intradérmica utilizando una sutura reabsorbible sintética monofilamento 4/0 (Gliconato) (Figura 7).

4. Microtomografía computarizada

1. Después de completar la cirugía y aún bajo anestesia general, realice una microtomografía computarizada para confirmar la colocación adecuada del implante.
2. Retire la rata de la cama de cirugía y colóquela en la cama de exploración. Localice la pierna operada utilizando el modo de exploración en vivo de micro-CT y centre el campo de visión en el implante.
   NOTA: Los parámetros de adquisición recomendados son un campo de visión de 5 mm, una resolución espacial de 0,0001 mm³, 50 kV, 200 μA y un tiempo de adquisición de 3 min.
3. Una vez adquirida la exploración, confirmar la distancia correcta entre la cara proximal del implante y la superficie de la meseta tibial, según el paso 5.2.1.
   NOTA: Este valor será útil para la estandarización de la técnica (Figura 8).

5. Cuidados postoperatorios

1. Después de la adquisición de imágenes, regrese a la rata a su jaula y monitoree hasta que se recupere por completo.
   NOTA: Esto tarda aproximadamente 5-10 min, dependiendo del modelo animal. Se espera que las ratas diabéticas permanezcan anestesiadas por más tiempo y tengan un tiempo de recuperación más largo debido a los cambios metabólicos asociados con la diabetes.
2. Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg) cada 6-8 h y meloxicam (5 mg/kg) cada 24 h, por vía subcutánea, hasta 72 h.
3. Tiempo de extracción de la sutura
   1. Examine la herida quirúrgica diariamente en busca de infección, integridad de la sutura u otros problemas, y retire los restos de sutura, si es necesario, 15 días después de la cirugía.

6. Eutanasia

1. Eutanasiar a los animales utilizando una cámara de CO₂ , de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud (NIH), con una tasa de llenado de CO₂ del 30%-70% del volumen de la cámara/min después del tiempo de implantación (4 semanas o 12 semanas).

7. Análisis postquirúrgico

1. Para ambos modelos (osteoporosis y diabetes), se extirpa la tibia por desarticulación después de la eutanasia para su posterior análisis.
   NOTA: En cuanto al análisis de micro-TC, los datos permitieron calcular el contacto hueso-implante (BIC). La adquisición de la TC se realizó utilizando los parámetros previamente descritos, y el análisis BIC se realizó dividiendo el área ósea (mm²) por el área del implante (mm²) calculada en la región cortical, adaptando un protocolo ya descrito en la literatura¹⁸. Se muestran imágenes representativas de cada modelo, osteoporosis (Figura 9) y diabetes (Figura 10).

Resultados

Fase quirúrgica
Es importante mencionar que ambos modelos animales utilizados en este estudio presentan ciertas limitaciones debido a las enfermedades inducidas. Estas limitaciones con respecto a la manipulación de tejidos duros y blandos se reflejan durante el procedimiento quirúrgico.

En el modelo diabético, la rata es más grande, lo que dificulta la estabilización de las patas durante los procedimientos quirúrgicos. Esto aumenta e...

Discusión

Aunque la rata es un modelo ampliamente utilizado para el estudio de la osteointegración, es importante definir y describir una técnica quirúrgica reproducible para la colocación adecuada de implantes. Esta técnica podría servir de guía para la comunidad científica. Además, el hecho de que ciertas enfermedades, como la osteoporosis y la diabetes, alteren el metabolismo óseo implica mayores exigencias para el correcto diseño de los procedimientos quirúrgicos. La rata se compar...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G needles+A2:C30	Terumo	NN-2238R
4/0 monofilament synthetic resorbable suture	Braun ( MonoSyn)
5 mL, 10 mL syringes	Braun	4617100V-02 4606051V
Adson forceps	Antão Medical	Ref: A586
BBDR ( Biobreeding Diabetes Resistant ) Sprague Dawley Rats	Janvier Labs
Betadine	Mylan
Buprecare	Animalcare (UK)
Castroviejo Caliper 0-40 mm 15 cm angled	UL AMIN Industries
Castroviejo Needle Holder	Antão Medical	Ref: AM1702
Dental surgery scissors curved and straight	Antão Medical	AMA603 / AMA600
Electric shaver	Oster Pro 3000i	34264482227
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T	Ref: 11150-10
Gauze pads	COVIDIEN	441001
Glucometer	Menarini (Italy)
Helicoidal Drill / OSTEO-PIN DRILL Ø1.6 mm	soadco	Ref. OS-8001
Implants / SCREW OSTEO-PIN Ø1.8 x 2.0 mm	soadco	Ref. OS-3
Isoflo	Le Vet Pharma (Netherlands)
Lance pilot drill / Lanceolate Drill (DS)	soadco	Ref. 10 02 01 T
Latex gloves - Surgical gloves sterile	Hartmann	Ref: 9426495
Lucas Surgical Curette	Antão Medical	Ref: AMA940-3
Metacam	Boehringer Ingelheim(Germany)
Micro forceps straight	nopa	Ref: AB 542/12
Micro-CT scan( Quantum Fx microCT )	Perkin Elmer (US)
Osteoporotic Sprague Dawley females Rats	Janvier Labs
Periosteal elevator -  Molt 2-4	Antão Medical	Ref: A1564
Physiologic solution for Irrigation	Hygitech	Ref:10238
Scalpel Blade Carbon Steel 15C	Razor Med	Ref: 02846
Sterile Gauze Swabs	Alledental	Ref: 270712
Sterile Irrigation system	Hygitech	Ref:HY1-110001D
Sterile towels (1 piece per animal)	Dinarex	4410
Surgical contra-angle handpiece	W&H	Ref: WS-75 LED G
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 08877
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 01309
Surgical Electric Motor	WH Implantmed Type: SI-1023	Ref: 30288000
Surgical scalpel handle	AsaDental	Ref: 0350-3
Towel clamps	Xelpov surgical	AF-773-11
Ultrasonic device	J.P. Selecta, Abrera, Spain