Technique chirurgicale d’implantation osseuse pour les modèles de tibia de rat de diabète et d’ostéoporose

Résumé

La pose d’implants dans un modèle de rat est une procédure expérimentale essentielle pour la recherche clinique. Cette étude présente un protocole chirurgical complet pour l’implantation d’implants en titane dans le tibia de modèles de rats atteints de diabète et d’ostéoporose.

Résumé

Le rat a longtemps servi de modèle animal précieux en dentisterie implantaire et en orthopédie, en particulier dans l’étude des interactions entre les biomatériaux et le tissu osseux. Le tibia du rat est fréquemment choisi en raison de son accès chirurgical facile à travers de fines couches de tissus (peau et muscle) et de la forme aplatie de sa face médiale, facilitant l’insertion chirurgicale de dispositifs intra-osseux. De plus, ce modèle permet l’induction de maladies spécifiques, imitant diverses conditions cliniques pour évaluer les réponses biologiques à différentes conditions d’implant telles que la géométrie, la texture de surface ou les indices biologiques. Cependant, malgré sa structure corticale robuste, certains dispositifs intra-osseux peuvent nécessiter des adaptations de conception et de taille pour une implantation réussie. Par conséquent, l’établissement de méthodes chirurgicales standardisées pour manipuler les tissus mous et durs dans la région d’implantation est essentiel pour garantir un placement correct de l’implant ou du dispositif à vis, en particulier dans des domaines tels que la dentisterie implantaire et l’orthopédie. Cette étude a porté sur quatre-vingts rats Sprague Dawley divisés en deux groupes en fonction de leurs maladies respectives : le groupe 1 avec l’ostéoporose et le groupe 2 avec le diabète de type 2. Les implantations ont été réalisées à 4 semaines et à 12 semaines, le même chirurgien suivant une technique chirurgicale cohérente. Une réponse biologique positive a été observée, indiquant une ostéointégration complète de tous les implants placés. Ces résultats valident le succès du protocole chirurgical, qui peut être répliqué pour d’autres études et servir de référence pour la communauté des biomatériaux. Notamment, les valeurs d’ostéointégration sont restées stables à 4 semaines et à 12 semaines pour les deux modèles de maladie, démontrant une intégration durable de l’implant dans le temps et mettant l’accent sur l’établissement d’une connexion osseuse intime dès 4 semaines.

Introduction

Le choix courant des rats comme sujets d’expérience est dû au fait qu’ils sont faciles à élever et relativement peu coûteux par rapport aux modèles animaux plus grands. L’émergence de nouvelles procédures, telles que la reproduction fiable d’un trouble, par exemple l’ostéoporose ou le diabète, rend ce modèle particulièrement utile pour analyser l’utilisation potentielle des traitements et/ou l’influence de la maladie dans la réponse biologique aux médicaments et aux dispositifs ou procédures chirurgicaux ^1,2.

Le gain de masse osseuse du rat se produit principalement au cours des 6 premiers mois de la vie, bien que certains chercheurs pensent que l’os long se développe constamment pendant au moins un an avec une augmentation progressive de la longueur¹. Avec le vieillissement, il y a une transition du modelage au remodelage, qui ne se produit pas dans tous les cas de manière égale dans tous les os². Les rats Sprague Dawley femelles grandissent plus lentement que les rats mâles et atteignent un pic de poids inférieur à celui des rats mâles¹. L’allongement osseux continu et la dynamique variée du remodelage osseux chez le rat sont des facteurs qui doivent être pris en compte lors de la résolution de problèmes de santé humaine ; Cependant, il n’a pas encore été possible de trouver de recherche expérimentale montrant soit le développement d’os de rat tout au long de la vie, soit l’incapacité de l’espèce à remodeler l’os¹. Si l’expérience commence vers l’âge de 10 mois, une marge d’au moins 1 mm de la plaque de croissance du tibia doit être laissée intacte en raison de cette croissance osseuse longitudinale, une question à prendre en compte dans les études d’implants dentaires². Les hormones sont également un paramètre clé dans la recherche osseuse puisqu’à l’âge de 8 mois, les rats mâles avaient une largeur osseuse supérieure de 22 % et une résistance à la rupture supérieure de 33 % à celle des femelles dans le tibia³.

La reproduction fiable d’un trouble est donc très importante en orthopédie et en dentisterie implantaire, car l’ostéointégration d’une vis orthopédique ou d’un implant dentaire est un processus complexe qui dépend de nombreux facteurs influençant la réponse systémique à l’implantation du dispositif dans l’os. Les troubles systémiques comme l’ostéoporose et le diabète sont connus pour affecter le taux de réussite en orthopédie et en dentisterie implantaire, de sorte que la reproduction fiable de ces troubles dans les modèles de rats peut être appliquée pour explorer des moyens de surmonter ces limitations.

Le tibia de rat, en raison de la facilité d’accès chirurgical, du volume osseux modéré et de la forme plate de la plaque médiale, le rend adapté aux expériences chirurgicales d’implantation osseuse ^4,5, et il a été utilisé dans de nombreuses études de recherche explorant les effets de la surface de l’implant sur l’ostéointégration ^4,5,6. Un nombre croissant d’études évaluent les effets sur l’ostéointégration des revêtements et des substances ajoutés à la surface de l’implant chez les animaux en bonne santé⁷ et chez les animaux fragilisés atteints de diabète ou d’ostéoporose 8,9,10,11,12,13,14.

Le nombre de dispositifs implantaires placés dans le tibia d’un rat est limité et peut différer selon le type d’étude. En fonction du nombre d’implants ou des conditions d’étude, les dimensions des dispositifs doivent être adaptées pour minimiser les traumatismes chirurgicaux. Dans les études avec un seul implant, il est possible de placer un implant presque de taille humaine (2,0 mm de diamètre et 4 à 5 mm de longueur), et un ancrage bi-cortical peut être réalisé 6,7,15,16. Les dimensions des implants dans les protocoles multi-implants doivent adopter une taille d’implant appropriée (1,5 mm de diamètre et 2,5 mm de longueur)^4,17.

La présente étude vise à décrire un protocole chirurgical standardisé pour la pose d’implants en titane sur le tibia de deux modèles de rats : le modèle d’ostéoporose et le modèle de rat diabétique. De plus, cette étude permet de tester le protocole chirurgical pour évaluer différents types de biofonctionnalisation de la surface de l’implant et son effet sur l’ostéointégration.

Un échantillon de 80 rats a été divisé en deux groupes. Dans le groupe 1, 40 femelles de Sprague Dawley ovariectomisées et 5 animaux fictifs ont été sélectionnés, d’un poids moyen de 484 g et d’un âge moyen de 12 semaines. Sur la base des recommandations du fournisseur (voir la table des matériaux), trois mois après la stérilisation, l’expérience a commencé. Cette période d’attente assurait la disparition des hormones sexuelles. L’ostéoporose a été confirmée au moment de la chirurgie sur la base d’une analyse osseuse par microtomodensitométrie (micro-TDM), qui reflétait une perte osseuse moyenne de 20 % par rapport au groupe fictif. Le groupe 2 était composé de 40 rats Sprague Dawley génétiquement modifiés BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) atteints de diabète de type II. Le poids moyen était de 730 g et l’âge moyen était de 12 semaines. Avant l’opération, l’état diabétique a été confirmé par trois jours consécutifs de mesures de glucose avec des résultats supérieurs à 200 mg / dL. Le glucose a été mesuré à l’aide d’un glucomètre pendant 6 heures de jeûne, et une goutte de sang a été recueillie par ponction de la queue.

Des implants en titane de grade 3 mesurant 2 mm de long et 1,8 mm de diamètre ont été utilisés. Tous les implants ont été stérilisés dans des conditions de salle blanche, en étant nettoyés par ultrasons au cyclohexane (3 fois pendant 2 min), à l’acétone (une fois pendant 1 min), à l’eau désionisée (3 fois pendant 2 min), à l’éthanol (3 fois pendant 2 min) et à l’acétone (3 fois pendant 2 min) à l’aide d’un bain à ultrasons (230 VAC, 50/60 Hz, 360 W). Ensuite, les échantillons ont été séchés avec de l’azote gazeux, et un faisceau d’azote à 0,5 bar a été appliqué directement sur les échantillons. Avant l’implantation, les implants ont d’abord été trempés dans de l’eau déminéralisée, puis immergés dans de l’éthanol à 70 % (v/v) pendant 10 min. Après cela, les implants ont été transférés dans des tubes de microcentrifugation stériles et conservés dans des conditions stériles jusqu’à l’opération.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément aux lignes directrices de la Communauté européenne pour la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (directive 2010/63/UE) telles que mises en œuvre dans la loi espagnole (décret royal 53/2013) et les règlements de la Generalitat de Catalunya (décret 214/97). L’approbation éthique pour toutes les procédures et manipulations d’animaux a été obtenue auprès du Comité d’éthique de l’expérimentation animale de l’Institut de Recerca Vall D’Hebron (numéro d’enregistrement 72/18 CEEA). Pour le modèle ostéoporotique, des rats Sprague Dawley femelles d’un poids moyen de 484 g et d’un âge moyen de 12 semaines ont été utilisés. En ce qui concerne le modèle diabétique, des rats femelles génétiquement modifiés BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) d’un poids moyen de 730 g et d’un âge moyen de 12 semaines ont été utilisés. Tous les animaux provenaient d’un fournisseur commercial. Les détails spécifiques des animaux, des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Anesthésie/pharmacologie et préparation des animaux

1. Administrer une analgésie préchirurgicale à l’aide de buprénorphine à 0,05 mg/kg et de méloxicam à 2 mg/kg par injections sous-cutanées 10 à 15 minutes avant de commencer l’intervention chirurgicale.
2. Réaliser une anesthésie intrachirurgicale avec de l’isoflurane inhalé : initier à 5 % à l’air frais lors de l’induction et maintenir à 3 %. Induire une anesthésie dans une chambre de rat et maintenir l’approvisionnement en isoflurane avec une adaptation conique du nez pendant la chirurgie.

2. Préparation à l’opération

1. Mesurez la température corporelle de l’animal anesthésié à l’aide d’une sonde rectale et utilisez un coussin chauffant à commande électronique pour le soutien thermique tout au long de l’intervention chirurgicale. Une pommade oculaire doit être appliquée avant le début de la chirurgie pour éviter la sécheresse de la cornée.
   REMARQUE : Si nécessaire, la pommade doit être réappliquée après avoir vérifié la sécheresse oculaire.
2. Coupez les poils avec un rasoir électrique et appliquez une crème dépilatoire pour éliminer toute fourrure restante.
3. Obtenez un champ chirurgical aseptique en nettoyant la peau du genou selon un schéma d’iode et d’éthanol à 70 % (v/v) à l’aide d’écouvillons stériles, en commençant par l’intérieur et en se déplaçant vers l’extérieur de la ligne d’incision sans retracer la trace. Effectuez un minimum de trois rotations de nettoyage consécutives (iode-éthanol-iode).
4. Isolez le champ opératoire en plaçant un champ chirurgical fenêtré stérile sur l’animal, en exposant la patte par l’ouverture centrale (figure 1).

3. Chirurgie

1. Exposition chirurgicale
   1. Faire une incision cutanée de pleine épaisseur d’environ 1 cm de longueur verticalement le long du bord proximal de la face antéromédiale du tibia, dans la région de la métaphyse pour exposer l’os (figure 2).
   2. Stabilisez la jambe et tirez la peau tendue contre l’os sous-jacent tout en faisant l’incision, en vous assurant qu’une incision propre reste au bon endroit. Pour ce faire, il faut nettoyer les saignements légers attendus à l’aide d’une compresse imbibée d’une solution saline (figure 2).
      REMARQUE : La peau du rat est fine et affaissée ou lâche. La stabilisation de la peau est cruciale et nécessaire.
   3. Détacher complètement le tissu de l’os à l’aide de petits élévateurs périostés (Figure 3).
   4. Exposer l’os jusqu’à l’identification de l’insertion du muscle tibial crânien, du muscle gracilis et du muscle latéral de la tête gastrocnémien dans le bord postérieur de la face médiale du tibia, en tant que tissu blanc fibreux adhérant fermement à l’os (Figure 3).
      REMARQUE : Il est important d’identifier ce groupe d’insertions musculaires pour permettre à l’implant d’être placé dans une région osseuse présentant des caractéristiques et des stimuli similaires sur l’ensemble de l’échantillon, quelle que soit la taille du rat.
2. Processus de forage
   1. Commencez le processus de forage à la bonne région entre la crête tibiale proximale et la limite postérieure de la face médiale de l’os du tibia, contiguë à l’insertion du muscle tibial crânien, du gracilis et du muscle latéral de la tête gastrocnémien, en évitant toute blessure musculaire.1
      REMARQUE : L’emplacement correct doit être à 5 mm ± 2 mm du plateau tibial.
   2. Forer avec un maximum de 150 tr/min (rotations/min) sous irrigation en solution saline à une température proche de 20 °C avec un moteur électrique chirurgical avec un contre-angle de réduction de 20:1.
      REMARQUE : Seulement deux exercices étaient nécessaires.
   3. Commencer avec une foreuse pilote à lance (figure 4) à une profondeur de 2,4 mm sous irrigation par solution saline.
      REMARQUE : Chaque exercice a eu un maximum de 10 utilisations.
   4. Comme deuxième foret, utilisez (figure 4) un foret hélicoïdal à une profondeur de 2,4 mm avec un diamètre de 1,6 mm sous une solution saline.
      REMARQUE : Chaque exercice a eu un maximum de 10 utilisations.
3. Pose d’implants
   1. Insérez l’implant à l’aide d’une pièce intermédiaire (Figure 5) fixée au contre-angle de réduction 20:1.
   2. Avant de placer l’implant, nettoyez l’implant de tout stérilisant chimique résiduel en le faisant pivoter dans le contre-angle avec une irrigation saline simultanée pendant 10 s (Figure 5).
   3. Placez l’implant en titane (2 mm dans le sens de la longueur et 1,8 mm de diamètre) à l’aide de la pièce intermédiaire à 20 tr/min tout en surveillant la valeur du couple en temps réel, en enregistrant le couple d’insertion maximal.
      REMARQUE : Une difficulté initiale d’insertion de l’implant est attendue en raison de la différence entre le foret final et l’implant, ainsi que du profil cylindrique de l’implant ; Cependant, cette difficulté initiale est rapidement normalisée dès que l’implant pénètre dans l’os cortical initial.
   4. Terminez l’insertion de l’implant avant qu’il ne passe complètement l’os cortical où il est inséré, c’est-à-dire la face médiale plate du tibia.
      REMARQUE : Au dernier moment de l’insertion de l’implant, il est important de laisser l’implant légèrement à l’extérieur de l’os cortical ou au niveau de l’os cortical où il est inséré, c’est-à-dire la face médiale plate du tibia, pour assurer la stabilité primaire (Figure 6).
4. Fermeture de la plaie
   1. Suturez les bords du tissu musculaire à l’aide de sutures internes simples à l’aide d’une suture synthétique résorbable 4/0 monofilament (glyconate) (Figure 7).
   2. Effectuez la fermeture de la peau à l’aide d’une suture intradermique à l’aide d’une suture synthétique résorbable 4/0 monofilament (glyconate) (Figure 7).

4. Micro-tomodensitométrie

1. Après avoir terminé l’opération et toujours sous anesthésie générale, effectuez un micro-scanner pour confirmer la bonne mise en place de l’implant.
2. Retirez le rat du lit d’opération et placez-le sur le lit d’examen. Localisez la jambe opérée à l’aide du mode de balayage en direct micro-CT et centrez le champ de vision sur l’implant.
   REMARQUE : Les paramètres d’acquisition recommandés sont un champ de vision de 5 mm, une résolution spatiale de 0,0001 mm³, 50 kV, 200 μA et un temps d’acquisition de 3 min.
3. Une fois le scan acquis, confirmez la distance correcte entre la face proximale de l’implant et la surface du plateau tibial, conformément à l’étape 5.2.1.
   REMARQUE : Cette valeur sera utile pour la normalisation de la technique (Figure 8).

5. Soins postopératoires

1. Après l’acquisition de l’imagerie, remettez le rat dans sa cage et surveillez-le jusqu’à ce qu’il se rétablisse complètement.
   REMARQUE : Cela prend environ 5 à 10 minutes, selon le modèle d’animal. On s’attend à ce que les rats diabétiques restent anesthésiés plus longtemps et aient un temps de récupération plus long en raison des changements métaboliques associés au diabète.
2. Administrer de la buprénorphine (0,1 mg/kg) toutes les 6 à 8 h et du méloxicam (5 mg/kg) toutes les 24 h, par voie sous-cutanée, jusqu’à 72 h.
3. Temps de retrait des sutures
   1. Examinez la plaie chirurgicale tous les jours à la recherche d’une infection, d’une intégrité de la suture ou d’autres problèmes, et retirez les restes de suture, si nécessaire, 15 jours après la chirurgie.

6. Euthanasie

1. Euthanasier les animaux à l’aide d’une chambre de CO₂ , selon les directives des National Institutes of Health (NIH), avec un taux de remplissage de CO₂ de 30 % à 70 % du volume de la chambre/min après le temps d’implantation (4 semaines ou 12 semaines).

7. Analyse postopératoire

1. Pour les deux modèles (ostéoporose et diabète), enlever le tibia par désarticulation après euthanasie pour une analyse plus approfondie.
   REMARQUE : En ce qui concerne l’analyse micro-CT, les données ont permis de calculer le contact os-implant (BIC). L’acquisition de la tomodensitométrie a été réalisée à l’aide des paramètres décrits précédemment, et l’analyse BIC a été réalisée en divisant la surface osseuse (mm²) par la surface de l’implant (mm²) calculée au niveau de la région corticale, en adaptant un protocole déjà décrit dans la littérature¹⁸. Des images représentatives sont présentées pour chaque modèle, l’ostéoporose (figure 9) et le diabète (figure 10).

Résultats

Phase chirurgicale
Il est important de mentionner que les deux modèles animaux utilisés dans cette étude présentent certaines contraintes dues aux maladies induites. Ces contraintes concernant la manipulation des tissus durs et mous se reflètent lors de l’intervention chirurgicale.

Dans le modèle diabétique, le rat est plus gros, ce qui rend difficile la stabilisation des jambes pendant les interventions chirurgicales. Cela augment...

Discussion

Bien que le rat soit un modèle largement utilisé pour étudier l’ostéointégration, il est important de définir et de décrire une technique chirurgicale reproductible pour placer correctement les implants. Une telle technique pourrait servir de guide à la communauté scientifique. De plus, le fait que certaines maladies, telles que l’ostéoporose et le diabète, modifient le métabolisme osseux implique des exigences plus fortes pour concevoir correctement les procédures chiru...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G needles+A2:C30	Terumo	NN-2238R
4/0 monofilament synthetic resorbable suture	Braun ( MonoSyn)
5 mL, 10 mL syringes	Braun	4617100V-02 4606051V
Adson forceps	Antão Medical	Ref: A586
BBDR ( Biobreeding Diabetes Resistant ) Sprague Dawley Rats	Janvier Labs
Betadine	Mylan
Buprecare	Animalcare (UK)
Castroviejo Caliper 0-40 mm 15 cm angled	UL AMIN Industries
Castroviejo Needle Holder	Antão Medical	Ref: AM1702
Dental surgery scissors curved and straight	Antão Medical	AMA603 / AMA600
Electric shaver	Oster Pro 3000i	34264482227
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T	Ref: 11150-10
Gauze pads	COVIDIEN	441001
Glucometer	Menarini (Italy)
Helicoidal Drill / OSTEO-PIN DRILL Ø1.6 mm	soadco	Ref. OS-8001
Implants / SCREW OSTEO-PIN Ø1.8 x 2.0 mm	soadco	Ref. OS-3
Isoflo	Le Vet Pharma (Netherlands)
Lance pilot drill / Lanceolate Drill (DS)	soadco	Ref. 10 02 01 T
Latex gloves - Surgical gloves sterile	Hartmann	Ref: 9426495
Lucas Surgical Curette	Antão Medical	Ref: AMA940-3
Metacam	Boehringer Ingelheim(Germany)
Micro forceps straight	nopa	Ref: AB 542/12
Micro-CT scan( Quantum Fx microCT )	Perkin Elmer (US)
Osteoporotic Sprague Dawley females Rats	Janvier Labs
Periosteal elevator -  Molt 2-4	Antão Medical	Ref: A1564
Physiologic solution for Irrigation	Hygitech	Ref:10238
Scalpel Blade Carbon Steel 15C	Razor Med	Ref: 02846
Sterile Gauze Swabs	Alledental	Ref: 270712
Sterile Irrigation system	Hygitech	Ref:HY1-110001D
Sterile towels (1 piece per animal)	Dinarex	4410
Surgical contra-angle handpiece	W&H	Ref: WS-75 LED G
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 08877
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 01309
Surgical Electric Motor	WH Implantmed Type: SI-1023	Ref: 30288000
Surgical scalpel handle	AsaDental	Ref: 0350-3
Towel clamps	Xelpov surgical	AF-773-11
Ultrasonic device	J.P. Selecta, Abrera, Spain