糖尿病および骨粗鬆症のラット脛骨モデルに対する外科的骨移植技術

要約

ラットモデルへのインプラントの配置は、臨床研究に不可欠な実験的手順です。この研究では、糖尿病と骨粗鬆症のラットモデルの脛骨にチタンインプラントを埋め込むための包括的な外科的プロトコルを提示します。

要約

ラットは、インプラント歯科および整形外科、特に生体材料と骨組織との間の相互作用の研究において、貴重な動物モデルとして長い間役立ってきました。ラットの脛骨は、薄い組織層(皮膚と筋肉)を介した外科的アクセスが容易で、内側の顔の平らな形状により、骨内デバイスの外科的挿入を容易にするため、頻繁に選択されます。さらに、このモデルでは、さまざまな臨床状態を模倣して、形状、表面テクスチャ、生物学的手がかりなどのさまざまなインプラント条件に対する生物学的反応を評価することで、特定の疾患の誘発が可能になります。ただし、その堅牢な皮質構造にもかかわらず、特定の骨内デバイスでは、移植を成功させるためにデザインとサイズの適応が必要になる場合があります。したがって、インプラント領域の軟組織と硬組織の両方を操作するための標準化された外科的方法を確立することは、特にインプラント歯科や整形外科などの分野で、インプラントまたはスクリューデバイスの適切な配置を確保するために不可欠です。この研究では、80匹のSprague Dawleyラットを、それぞれの疾患に基づいて2つのグループに分けました:骨粗鬆症のグループ1と2型糖尿病のグループ2。移植は4週目と12週目で行われ、同じ外科医が一貫した手術技術に従っていました。肯定的な生物学的反応が観察され、配置されたすべてのインプラントの完全なオッセオインテグレーションが示されました。これらの結果は、外科的プロトコルの成功を検証し、他の研究で再現し、生体材料コミュニティのベンチマークとして役立つことができます。特に、オッセオインテグレーションの値は、両方の疾患モデルで4週間と12週間の両方で安定しており、インプラントの長期にわたる持続的な統合を示し、4週間という早い時期に親密な骨接続が確立されることを強調しています。

概要

実験対象としてラットが一般的に選択されるのは、ラットが繁殖が容易で、大型の動物モデルに比べて比較的安価であるという事実によるものです。骨粗鬆症や糖尿病などの障害の信頼性の高い再現などの新しい手順の出現により、このモデルは、治療の潜在的な使用および/または薬物および手術装置または手順に対する生物学的応答における疾患の影響を分析するのに特に有用になります^1,2。

ラットの骨量増加は、主に生後6か月の間に発生しますが、一部の研究者は、長骨が少なくとも1年間は絶えず成長し、長さが徐々に増加すると考えています¹。加齢に伴い、モデリングからリモデリングへの移行がありますが、これは骨全体ですべての場合に等しく発生するわけではありません²。雌のSprague Dawleyラットは、雄のラットよりも成長が遅く、雄のラットよりも体重のピークが低くなります¹。ラットの継続的な骨伸長と多様な骨リモデリングダイナミクスは、人間の健康問題に対処する際に考慮しなければならない要素です。しかし、生涯にわたるラットの骨の発達や、種が骨^1を再構築できないことを示す実験的研究はまだ見つかっていません。 実験が生後約10か月で開始された場合、この縦方向の骨の成長により、脛骨の成長板から少なくとも1 mmのマージンはそのまま残されるべきであり、歯科インプラント研究で考慮すべき問題^です2。ホルモンは骨研究の重要なパラメータでもあります。生後8か月の時点で、雄ラットは脛骨の雌よりも骨幅が22%大きく、破壊強度が33%大きい^{ことがわかりました3。}

したがって、整形外科用スクリューまたは歯科インプラントのオッセオインテグレーションは、骨へのデバイス埋め込みに対する全身反応に影響を与える多数の要因に依存する複雑なプロセスであるため、整形外科およびインプラント歯科では、障害の信頼性の高い再現が非常に重要です。骨粗鬆症や糖尿病などの全身性疾患は、整形外科やインプラント歯科の成功率に影響を与えることが知られているため、ラットモデルでこれらの障害を確実に再現することで、これらの制限を克服する方法を探求することができます。

ラットの脛骨は、外科的アクセスが容易で、骨量が適度で、内側プレート上の平らな形状により、外科的骨移植実験^4,5に適しており、インプラント表面がオッセオインテグレーションに及ぼす影響を調査する多数の調査研究で使用されてきました^4,5,6.健康な動物⁷と糖尿病または骨粗鬆症に罹患した罹患動物8,9,10,11,12,13,14の両方で、インプラント表面に添加されたコーティングおよび物質のオッセオインテグレーションへの影響を評価する研究が増えています。

1匹のラットの脛骨に埋め込むインプラントデバイスの数は限られており、研究の種類によって異なる場合があります。インプラントの数や研究条件に応じて、外科的外傷を最小限に抑えるようにデバイスの寸法を調整する必要があります。1つのインプラントを用いた研究では、ほぼ人間サイズのインプラント(直径2.0mm、長さ4〜5mm)を埋入することができ、両皮質固定を達成することができます6,7,15,16。マルチインプラントプロトコルのインプラントの寸法は、適切なインプラントサイズ(直径1.5mm、長さ2.5mm^)4,17を採用する必要があります。

本研究は、骨粗鬆症と糖尿病ラットモデルの 2 つのラットモデルの脛骨にチタンインプラントを埋入するための標準化された外科プロトコルを説明することを目的としています。さらに、この研究では、さまざまなタイプのインプラント表面の生体機能化とそのオッセオインテグレーションへの影響を評価するための外科的プロトコルのテストが可能になります。

80匹のラットのサンプルを2つのグループに分けました。グループ1では、卵巣摘出されたSprague Dawleyの雌40匹と偽動物5匹が選択され、平均体重は484g、平均年齢は12週齢でした。ベンダーの推奨( 材料表を参照)に基づき、去勢手術の3か月後に実験が開始されました。この待機期間により、性ホルモンの消失が確実になりました。骨粗鬆症は、マイクロコンピューター断層撮影法(マイクロCT)骨分析に基づいて手術時に確認され、偽群と比較して平均20%の骨量減少を反映しています。グループ2は、II型糖尿病の40匹のBBDR(Bio Breeding Diabetes Resistance)遺伝子組み換えSprague Dawleyラットで構成されていました。平均体重は730g、平均年齢は12週であった。手術前に、糖尿病の状態は 3 日間連続して血糖値を測定し、結果は 200 mg/dL を超えました。グルコースは、空腹時6時間にグルコメーターで測定され、尾部穿刺によって血滴が採取されました。

長さ2mm、直径1.8mmのグレード3チタンインプラントを使用しました。すべてのインプラントは、シクロヘキサン(2分間に3回)、アセトン(1分間に1回)、脱イオン水(2分間に3回)、エタノール(2分間に3回)、およびアセトン(2分間に3回)で超音波洗浄することにより、クリーンルーム条件で滅菌しました超音波浴(230VAC、50/60Hz、360W)。その後、試料を窒素ガスで乾燥させ、0.5バールの窒素ビームを直接試料に印加しました。移植に先立ち、インプラントをまず脱イオン水に浸し、次に70%エタノール(v/v)に10分間浸漬しました。この後、インプラントを滅菌マイクロ遠心チューブに移し、手術まで滅菌状態に保たれました。

プロトコル

すべての実験手順は、スペインの法律(Royal Decree 53/2013)およびGeneralitat de Catalunya規則(Decree 214/97)で実施されている、科学的目的で使用される動物の保護に関する欧州共同体ガイドライン(Directive 2010/63/EU)に従って実施されました。すべての動物処置および取り扱いに関する倫理承認は、Vall D'Hebron Institut de Recerca(登録番号72/18 CEEA)の動物実験倫理委員会から取得されました。骨粗鬆症モデルには、平均体重484g、平均年齢12週齢の雌Sprague Dawleyラットを使用しました。糖尿病モデルでは、平均体重730g、平均生後12週齢の遺伝子改変動物雌BBDR(Bio Breeding Diabetes Resistance)ラットを用いた。すべての動物は商業供給業者から供給されました。この研究で使用された動物、試薬、および機器の具体的な詳細は、 資料表に記載されています。

1. 麻酔・薬理学および動物の調製

1. ブプレノルフィンを0.05 mg / kgで、メロキシカムを2 mg / kgで使用して、外科的処置を開始する10〜15分前に皮下注射で術前鎮痛を投与します。.
2. 吸入イソフルランを使用して手術内麻酔を行う:導入中に新鮮な空気で5%から開始し、3%に維持します。ラットチャンバーで麻酔を誘発し、手術中は円錐形の鼻順応でイソフルランの供給を維持します。

2. 手術の準備

1. 麻酔をかけた動物の体温を直腸プローブで測定し、電子制御の加熱パッドを使用して手術中ずっと熱サポートを行います。角膜の乾燥を避けるために、手術開始前に眼軟膏を塗布する必要があります。
   注:必要に応じて、目の乾燥を確認した後、軟膏を再塗布する必要があります。
2. 電気シェーバーで髪を整え、脱毛クリームを塗って残った毛を取り除きます。
3. 滅菌綿棒を使用してヨウ素と70%(v / v)エタノールのパターンで膝の皮膚を洗浄することにより、無菌手術野を取得します。最低3回連続してクリーニングローテーションを実行します(ヨウ素-エタノール-ヨウ素)。
4. 無菌の穴あき手術用ドレープを動物の上に配置して手術野を分離し、中央の開口部から脚を露出させます(図1)。

3. 手術

1. 外科的曝露
   1. 骨幹端領域に、脛骨の前内側面の近位境界に沿って垂直に長さ約 1 cm の全層皮膚切開を行い、骨を露出させます (図 2)。
   2. 脚を安定させ、切開を行いながら皮膚を下の骨に張り詰めて引っ張り、きれいな切開が正しい位置に留まるようにします。生理食塩水に浸した湿布で予想される光の出血を洗浄して管理します(図2)。
      注:ラットの皮膚は薄く、たるんでいるか、ゆるんでいます。肌の安定化は重要であり、必要です。
   3. 小さな骨膜エレベーターを使用して、組織を骨から完全に剥離します(図3)。
   4. 脛骨内側面の後縁に 脛骨頭蓋筋、 グラシリス 、 および腓腹筋の外側頭筋が挿入され、繊維状の白い組織が骨にしっかりと付着していることが確認されるまで、骨を露出させます(図3)。
      注:ラットのサイズに関係なく、サンプル全体で同様の特性と刺激を持つ骨領域にインプラントを配置できるようにするために、この筋肉挿入のグループを特定することが重要です。
2. 穴あけ加工
   1. 近位脛骨稜と脛骨の内側面の後縁との間の正しい領域から、 脛骨頭蓋筋、 グラシリス 、 および腓腹筋の外側頭筋の挿入に隣接して、筋肉の損傷を避けて、穴あけプロセスを開始します。
      注意: 正しい位置は、脛骨プラトーから5 mm±2 mmである必要があります。
   2. 20:1の減少コントラアングルを持つ外科用電気モーターを使用して、20°Cに近い温度で生理食塩水灌漑下で最大150rpm(回転/分)でドリルします。
      注:必要なドリルは2つだけでした。
   3. 生理食塩水灌漑下で深さ2.4mmのランスパイロットドリル(図4)から始めます。
      注意: 各ドリルには最大10回の用途がありました。
   4. 2番目のドリルとして、塩水の下で深さ2.4mm、直径1.6mmのツイストデザインドリルを使用します(図4)。
      注意: 各ドリルには最大10回の用途がありました。
3. インプラント埋入
   1. 20:1のリダクションコントラアングルに取り付けられた中間ピース(図5)を使用してインプラントを挿入します。
   2. インプラントを埋入する前に、10秒間同時に生理食塩水灌漑を行いながらインプラントを逆角度に回転させることにより、残留化学滅菌剤からインプラントを清掃します(図5)。
   3. 中間ピースを使用してチタンインプラント(縦2mm、直径1.8mm)を20rpmで埋入し、リアルタイムのトルク値を監視しながら、最大挿入トルクを記録します。
      注:インプラントの挿入は、最終的なドリルとインプラントの違い、およびインプラントの円筒形プロファイルにより、最初は困難になることが予想されます。しかし、この初期の困難さは、インプラントが最初の皮質骨を貫通するとすぐに正常化されます。
   4. インプラントが挿入される皮質骨、つまり脛骨の平らな内側面を完全に通過する前に、インプラントの挿入を完了します。
      注:インプラント挿入の最終瞬間には、インプラントを皮質骨の少し外側、またはインプラントが挿入される皮質骨と同じ高さ、つまり脛骨の平らな内側面に置いて、一次安定性を確保することが重要です(図6)。
4. 創傷閉鎖
   1. 4/0モノフィラメント合成吸収性縫合糸(グリコネート)を使用して、単純な内部縫合糸で筋肉組織の境界を縫合します(図7)。
   2. 4/0モノフィラメント合成吸収性縫合糸(グリコネート)を使用して、皮内縫合糸で皮膚閉鎖を行います(図7)。

4. マイクロCTスキャン

1. 手術が完了した後、全身麻酔下で、マイクロCTスキャンを実施して、適切なインプラント埋入を確認します。
2. ラットを手術ベッドから取り出し、スキャンベッドに置きます。マイクロCTライブスキャンモードを使用して手術した脚の位置を特定し、視野をインプラントの中央に配置します。
   注:推奨される取得パラメータは、視野角5 mm、空間分解能0.0001 mm³、50 kV、200 μA、取得時間3分です。
3. スキャンが取得されたら、ステップ5.2.1に従って、インプラントの近位面と脛骨プラトーの表面との間の正しい距離を確認します。
   注:この値は、手法の標準化に役立ちます(図8)。

5. 術後のケア

1. 画像取得後、ラットをケージに戻し、完全に回復するまで監視します。
   注:これには、動物モデルにもよりますが、約5〜10分かかります。糖尿病ラットは、糖尿病に伴う代謝変化により、より長く麻酔をかけられ、回復時間が長くなることが予想されます。
2. ブプレノルフィン(0.1 mg / kg)を6〜8時間ごとに、メロキシカム(5 mg / kg)を24時間ごとに皮下投与し、最大72時間皮下投与します。.
3. 縫合糸の除去時間
   1. 手術創に感染、縫合糸の完全性、またはその他の問題がないか毎日検査し、手術後15日で必要に応じて縫合糸の残りを取り除きます。

6.安楽死

1. 国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従って、移植時間(4週間または12週間)後のチャンバー容積/分の30%〜70%の_CO2充填率で、_CO2チャンバーを使用して動物を安楽死させます。

7. 術後解析

1. 両方のモデル(骨粗鬆症と糖尿病)について、安楽死後に解体によって脛骨を切除し、さらなる分析を行います。
   注:マイクロCT分析に関しては、骨インプラント接触(BIC)を計算するためのデータが許可されています。CT取得は、前述のパラメータを用いて実施し、BIC分析は、骨領域(mm²)を皮質領域で計算されたインプラント面積(mm²)で割ることによって、文献¹⁸に既に記載されているプロトコルを適応させて行った。骨粗鬆症(図9)と糖尿病(図10)の各モデルについて、代表的な画像を示します。

結果

外科的段階
この研究で使用された両方の動物モデルには、誘発された疾患による特定の制約があることに言及することが重要です。硬組織と軟組織の操作に関するこれらの制約は、外科的処置中に反映されます。

糖尿病モデルでは、ラットの方が大きいため、外科的処置中に脚を安定させることが難しくなっています。これによ?...

ディスカッション

ラットはオッセオインテグレーションの研究に広く使用されているモデルですが、インプラントを適切に配置するための再現可能な外科的手法を定義して説明することが重要です。このような手法は、科学界のガイドとして役立つ可能性があります。さらに、骨粗鬆症や糖尿病などの特定の疾患が骨代謝を変化させるという事実は、外科的処置を正しく設計すること...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G needles+A2:C30	Terumo	NN-2238R
4/0 monofilament synthetic resorbable suture	Braun ( MonoSyn)
5 mL, 10 mL syringes	Braun	4617100V-02 4606051V
Adson forceps	Antão Medical	Ref: A586
BBDR ( Biobreeding Diabetes Resistant ) Sprague Dawley Rats	Janvier Labs
Betadine	Mylan
Buprecare	Animalcare (UK)
Castroviejo Caliper 0-40 mm 15 cm angled	UL AMIN Industries
Castroviejo Needle Holder	Antão Medical	Ref: AM1702
Dental surgery scissors curved and straight	Antão Medical	AMA603 / AMA600
Electric shaver	Oster Pro 3000i	34264482227
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T	Ref: 11150-10
Gauze pads	COVIDIEN	441001
Glucometer	Menarini (Italy)
Helicoidal Drill / OSTEO-PIN DRILL Ø1.6 mm	soadco	Ref. OS-8001
Implants / SCREW OSTEO-PIN Ø1.8 x 2.0 mm	soadco	Ref. OS-3
Isoflo	Le Vet Pharma (Netherlands)
Lance pilot drill / Lanceolate Drill (DS)	soadco	Ref. 10 02 01 T
Latex gloves - Surgical gloves sterile	Hartmann	Ref: 9426495
Lucas Surgical Curette	Antão Medical	Ref: AMA940-3
Metacam	Boehringer Ingelheim(Germany)
Micro forceps straight	nopa	Ref: AB 542/12
Micro-CT scan( Quantum Fx microCT )	Perkin Elmer (US)
Osteoporotic Sprague Dawley females Rats	Janvier Labs
Periosteal elevator -  Molt 2-4	Antão Medical	Ref: A1564
Physiologic solution for Irrigation	Hygitech	Ref:10238
Scalpel Blade Carbon Steel 15C	Razor Med	Ref: 02846
Sterile Gauze Swabs	Alledental	Ref: 270712
Sterile Irrigation system	Hygitech	Ref:HY1-110001D
Sterile towels (1 piece per animal)	Dinarex	4410
Surgical contra-angle handpiece	W&H	Ref: WS-75 LED G
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 08877
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 01309
Surgical Electric Motor	WH Implantmed Type: SI-1023	Ref: 30288000
Surgical scalpel handle	AsaDental	Ref: 0350-3
Towel clamps	Xelpov surgical	AF-773-11
Ultrasonic device	J.P. Selecta, Abrera, Spain