טכניקת השתלת עצם כירורגית לטיביה חולדה מודלים של סוכרת ואוסטאופורוזיס

Summary

מיקום שתלים במודל חולדה הוא הליך ניסיוני חיוני למחקר קליני. מחקר זה מציג פרוטוקול כירורגי מקיף להשתלת שתלי טיטניום בשוקה של מודלים של חולדות עם סוכרת ואוסטאופורוזיס.

Abstract

החולדה משמשת מזה זמן רב כמודל בעל ערך ברפואת שיניים ובאורתופדיה, במיוחד בחקר יחסי הגומלין בין ביו-חומרים לרקמת עצם. השוקה של החולדה נבחרת לעתים קרובות בשל הגישה הכירורגית הקלה שלה דרך שכבות רקמה דקות (עור ושריר) והצורה השטוחה של פניה המדיאליות, מה שמקל על החדרה כירורגית של מכשירים תוך אוסיים. בנוסף, מודל זה מאפשר השראת מחלות ספציפיות, תוך חיקוי מצבים קליניים שונים כדי להעריך תגובות ביולוגיות למצבי שתל שונים כמו גיאומטריה, מרקם פני השטח או רמזים ביולוגיים. עם זאת, למרות המבנה קליפת המוח החזק שלה, התקנים intraosseous מסוימים עשויים לדרוש התאמות בעיצוב ובגודל עבור השתלה מוצלחת. לכן, קביעת שיטות כירורגיות סטנדרטיות למניפולציה של רקמות רכות וקשות באזור ההשתלה חיונית להבטחת מיקום תקין של שתלים או מכשירי בורג, במיוחד בתחומים כמו רפואת שיניים ואורתופדיה. מחקר זה כלל שמונים חולדות Sprague Dawley שחולקו לשתי קבוצות בהתבסס על מחלותיהן: קבוצה 1 עם אוסטאופורוזיס וקבוצה 2 עם סוכרת מסוג 2. ההשתלות בוצעו לאחר 4 שבועות ו -12 שבועות, כאשר אותו מנתח עוקב אחר טכניקה כירורגית עקבית. נצפתה תגובה ביולוגית חיובית, המעידה על אוסאואינטגרציה מלאה של כל השתלים שהונחו. תוצאות אלה מאמתות את הצלחת הפרוטוקול הניתוחי, אשר ניתן לשכפל למחקרים אחרים ולשמש אמת מידה לקהילת הביו-חומרים. יש לציין כי ערכי האוסאואינטגרציה נותרו יציבים הן לאחר 4 שבועות והן לאחר 12 שבועות עבור שני מודלי המחלה, מה שמראה שילוב עמיד של השתל לאורך זמן ומדגיש יצירת חיבור עצם אינטימי כבר בגיל 4 שבועות.

Introduction

הבחירה הנפוצה של חולדות כנבדקים ניסיוניים נובעת מהעובדה שהן קלות לגידול וזולות יחסית בהשוואה למודלים גדולים יותר של בעלי חיים. הופעתם של הליכים חדשים, כגון רבייה אמינה של הפרעה, למשל, אוסטאופורוזיס או סוכרת, הופכת מודל זה שימושי במיוחד לניתוח השימוש הפוטנציאלי בטיפולים ו / או השפעת המחלה בתגובה הביולוגית לתרופות ומכשירים כירורגיים או הליכים ^1,2.

העלייה במסת העצם של החולדה מתרחשת בעיקר במהלך 6 החודשים הראשונים לחיים, אם כי כמה חוקרים מאמינים כי העצם הארוכה גדלה כל הזמן במשך שנה לפחות עם עלייה הדרגתית באורך¹. עם ההזדקנות, יש מעבר מדוגמנות לשיפוץ, אשר אינו מתרחש בכל המקרים באופן שווה לאורך העצמות². נקבות חולדות Sprague Dawley גדלות לאט יותר מחולדות זכרים ומשיגות שיא משקל נמוך יותר מחולדות זכרים¹. התארכות עצם מתמשכת ודינמיקה מגוונת של עיצוב עצם בחולדות הם גורמים שיש לקחת בחשבון כאשר מטפלים בבעיות בריאות האדם; עם זאת, עדיין לא ניתן למצוא מחקר ניסיוני שמראה התפתחות עצם חולדה לכל החיים או חוסר יכולת של המין לעצב מחדש עצם¹. אם הניסוי מתחיל בסביבות גיל 10 חודשים, יש להשאיר שוליים של לפחות 1 מ"מ מלוחית הגדילה של השוקה ללא פגע עקב צמיחת עצם אורכית זו, נושא שיש לשקול במחקרי שתלים דנטליים². הורמונים הם גם פרמטר מרכזי במחקר העצם, שכן בגיל 8 חודשים, חולדות זכרים נמצאו בעלי רוחב עצם גדול יותר ב-22% וכוח שבירה גדול ב-33% מאשר נקבות בשוקה³.

לכן שכפול אמין של הפרעה חשוב מאוד באורתופדיה וברפואת שיניים עם שתלים, שכן אוסאואינטגרציה של בורג אורתופדי או שתל דנטלי היא תהליך מורכב התלוי בגורמים רבים המשפיעים על התגובה המערכתית להשתלת המכשיר בעצם. הפרעות סיסטמיות כמו אוסטאופורוזיס וסוכרת ידועות כמשפיעות על שיעור ההצלחה באורתופדיה וברפואת שיניים עם שתלים, ולכן ניתן ליישם את השכפול האמין של הפרעות אלה במודלים של חולדות כדי לחקור דרכים להתגבר על מגבלות אלה.

טיביה של חולדה, בשל הגישה הכירורגית הקלה, נפח העצם המתון והצורה השטוחה על הצלחת המדיאלית, הופכת אותה למתאימה לניסויי השתלת עצם כירורגיים ^4,5, והיא שימשה במחקרים רבים שבדקו את ההשפעות של משטח השתל על אוסאואינטגרציה ^4,5,6. מספר גדל והולך של מחקרים מעריכים את ההשפעות על אוסאואינטגרציה של ציפויים וחומרים שנוספו למשטח השתל הן בבעלי חיים בריאים⁷ והן בבעלי חיים פגועים הסובלים מסוכרת או אוסטאופורוזיס 8,9,10,11,12,13,14.

מספר מכשירי השתל המוצבים בשוקה של חולדה אחת מוגבל ויכול להשתנות בהתאם לסוג המחקר. בהתאם למספר השתלים או תנאי המחקר, יש להתאים את מידות המכשירים כדי למזער טראומה כירורגית. במחקרים עם שתל אחד, ניתן להציב שתל כמעט בגודל אנושי (קוטר 2.0 מ"מ ואורך 4 עד 5 מ"מ), ולעגון דו-קורטיקלי ניתן להשיג 6,7,15,16. מידות השתלים בפרוטוקולים מרובי שתלים צריכות לאמץ גודל שתל מתאים (קוטר 1.5 מ"מ ואורך 2.5 מ"מ)^4,17.

המחקר הנוכחי נועד לתאר פרוטוקול כירורגי סטנדרטי למיקום שתל טיטניום על השוקה של שני מודלים של חולדות: אוסטאופורוזיס ומודל חולדות סוכרת. יתר על כן, מחקר זה מאפשר לבחון את הפרוטוקול הכירורגי כדי להעריך סוגים שונים של ביו-פונקציונליזציה של פני השטח של השתל והשפעתו על אוסאואינטגרציה.

מדגם של 80 חולדות חולק לשתי קבוצות. בקבוצה 1 נבחרו 40 נקבות Sprague Dawley שעברו כריתת שחלות ו-5 חיות דמה, עם משקל ממוצע של 484 גרם וגיל ממוצע של 12 שבועות. בהתבסס על המלצות ספקים (ראו טבלת חומרים), שלושה חודשים לאחר הסירוס, החל הניסוי. תקופת המתנה זו הבטיחה את היעלמותם של הורמוני המין. אוסטאופורוזיס אושרה בזמן הניתוח בהתבסס על ניתוח עצם טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (micro-CT), אשר שיקף ממוצע של 20% אובדן עצם בהשוואה לקבוצת דמה. קבוצה 2 כללה 40 חולדות BBDR (Bio Breeding Diabetes Resistant) מהונדסות-גנטית עם סוכרת מסוג II. המשקל הממוצע היה 730 גרם, והגיל הממוצע היה 12 שבועות. לפני הניתוח, מצב הסוכרת אושר עם שלושה ימים רצופים של מדידות גלוקוז עם תוצאות גבוהות מ 200 מ"ג / ד"ל. גלוקוז נמדד עם גלוקומטר ב 6 שעות של צום, וטיפת דם נאספה על ידי ניקוב זנב.

נעשה שימוש בשתלי טיטניום דרגה 3 באורך 2 מ"מ ובקוטר 1.8 מ"מ. כל השתלים עוקרו בתנאי חדר נקי, על ידי ניקוי אולטרה-סאונד בציקלוהקסאן (3 פעמים למשך 2 דקות), אצטון (פעם אחת למשך דקה), מים נטולי יונים, (3 פעמים למשך 2 דקות), אתנול (3 פעמים למשך 2 דקות) ואצטון (3 פעמים למשך 2 דקות) באמצעות אמבט אולטרסאונד (230 וולט AC , 50/60 הרץ, 360 ואט). לאחר מכן, הדגימות יובשו בגז חנקן, וקרן חנקן בעוצמה של 0.5 בר הופעלה ישירות על הדגימות. לפני ההשתלה, השתלים הושרו תחילה במים שעברו דה-יוניזציה ולאחר מכן הוטבלו באתנול 70% (v/v) למשך 10 דקות. לאחר מכן הועברו השתלים לצינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליות, והוחזקו בתנאים סטריליים עד לניתוח.

Protocol

כל הליכי הניסוי נערכו בהתאם להנחיות הקהילה האירופית להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות (דירקטיבה 2010/63/EU) כפי שיושמו בחוק הספרדי (צו מלכותי 53/2013) ובתקנות Generalitat de Catalunya (צו 214/97). אישור אתיקה לכל הנהלים והטיפול בבעלי חיים התקבל מוועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של מכון ואל ד'חברון דה רצ'רקה (מספר רישום 72/18 CEEA). עבור המודל האוסטיאופורוטי, נקבות חולדות Sprague Dawley עם משקל ממוצע של 484 גרם וגיל ממוצע של 12 שבועות נוצלו. באשר למודל הסוכרתי, הועסקו חולדות BBDR (עמידות לסוכרת בגידול ביולוגי) מהונדסות, בעלות משקל ממוצע של 730 גרם וגיל ממוצע של 12 שבועות. כל בעלי החיים הגיעו מספק מסחרי. הפרטים הספציפיים של בעלי החיים, הריאגנטים והציוד שנעשה בהם שימוש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הרדמה/פרמקולוגיה והכנת בעלי חיים

1. ניהול שיכוך כאבים טרום ניתוחי באמצעות buprenorphine ב 0.05 מ"ג / ק"ג ו meloxicam ב 2 מ"ג / ק"ג באמצעות זריקות תת עוריות 10-15 דקות לפני תחילת ההליך הכירורגי.
2. לבצע הרדמה תוך ניתוחית עם איזופלורן בשאיפה: להתחיל ב 5% באוויר צח במהלך הזירוז ולשמור על 3%. יש להשרות הרדמה בתא חולדה ולשמור על אספקת איזופלורן עם הסתגלות חרוטית לאף במהלך הניתוח.

2. הכנה לניתוח

1. מדדו את חום הגוף של בעל החיים המורדם באמצעות בדיקה רקטלית והשתמשו בכרית חימום מבוקרת אלקטרונית לתמיכה תרמית לאורך כל ההליך הכירורגי. יש למרוח משחת עיניים לפני תחילת הניתוח כדי למנוע יובש בקרנית.
   הערה: במידת הצורך, יש למרוח מחדש את המשחה לאחר בדיקת יובש בעיניים.
2. גזרו את השיער עם מכונת גילוח חשמלית ומרחו קרם להסרת שיער כדי לחסל את שאריות הפרווה.
3. קבל שדה כירורגי אספטי על ידי ניקוי עור הברך בתבנית של יוד ואתנול 70% (v/v) באמצעות מקלונים סטריליים, החל מבפנים ונע החוצה את קו החתך מבלי לחזור. בצעו לפחות שלושה סיבובי ניקוי רצופים (יוד-אתנול-יוד).
4. בודדו את שדה הניתוח על-ידי הצבת וילון כירורגי סטרילי מעל החיה, וחשיפת הרגל דרך הפתח המרכזי (איור 1).

3. ניתוח

1. חשיפה כירורגית
   1. בצעו חתך עור בעובי מלא באורך של כ-1 ס"מ במאונך לאורך הגבול הפרוקסימלי של הפנים האנטרומדיאליות של השוקה, באזור המטפיזיה, כדי לחשוף את העצם (איור 2).
   2. ייצבו את הרגל ומשכו את העור צמוד לעצם שמתחתיה תוך כדי ביצוע החתך, כדי להבטיח שהחתך הנקי יישאר במיקום הנכון. הסתדרו על-ידי ניקוי הדימום הקל הצפוי בעזרת דחיסה ספוגה בתמיסת מלח (איור 2).
      הערה: עור החולדה דק ונפול או רופף. ייצוב העור הוא קריטי ונדרש.
   3. נתקו לחלוטין את הרקמה מהעצם באמצעות מעליות פריאוסטליות קטנות (איור 3).
   4. חשוף את העצם עד לזיהוי החדרת שריר הטיביאליס קרניאליס, הגרציליס ושריר הראש הצידי גסטרוקנמיוס בגבול האחורי של האספקט המדיאלי של השוקה, כרקמה לבנה סיבית הנצמדת היטב לעצם (איור 3).
      הערה: חשוב לזהות קבוצה זו של החדרות שרירים כדי לאפשר לשתל להיות ממוקם באזור עצם עם מאפיינים וגירויים דומים לאורך כל הדגימה, ללא קשר לגודל החולדה.
2. תהליך הקידוח
   1. התחל את תהליך הקידוח באזור הנכון בין הפסגה הטיביאלית הפרוקסימלית לבין הגבול האחורי של הפנים המדיאלי של עצם השוקה, רציף להחדרת שריר הטיביאליס קרניאליס, הגרציליס ושריר הראש הצידי גסטרוקנמיוס, תוך הימנעות מכל פגיעה בשריר.1
      הערה: המיקום הנכון צריך להיות 5 מ"מ ± 2 מ"מ מהרמה הטיביאלית.
   2. קידוח עם מקסימום של 150 סל"ד (סיבובים לדקה) תחת השקיה בתמיסת מלח בטמפרטורה קרובה ל -20 ° C עם מנוע חשמלי כירורגי עם זווית נגדית הפחתה של 20: 1.
      הערה: נדרשו רק שני תרגילים.
   3. התחילו עם מקדח פיילוט לאנס (איור 4) בעומק של 2.4 מ"מ תחת השקיה של תמיסת מלח.
      הערה: לכל מקדחה היו מקסימום 10 שימושים.
   4. כמקדחה שנייה, השתמש (איור 4) במקדח עיצוב פיתול בעומק של 2.4 מ"מ בקוטר של 1.6 מ"מ תחת תמיסת מלח.
      הערה: לכל מקדחה היו מקסימום 10 שימושים.
3. מיקום השתל
   1. הכנס את השתל עם חתיכת ביניים (איור 5) המחוברת לזווית הנגדית של הפחתה של 20:1.
   2. לפני הנחת השתל, נקו את השתל מכל חומר מעקר כימי שאריות על-ידי סיבובו בזווית הנגדית עם השקיה במי מלח בו זמנית למשך 10 שניות (איור 5).
   3. מקם את שתל הטיטניום (2 מ"מ לאורך וקוטר 1.8 מ"מ) באמצעות חתיכת הביניים ב-20 סל"ד תוך ניטור ערך המומנט בזמן אמת, תוך רישום מומנט ההחדרה המרבי.
      הערה: צפוי קושי ראשוני בהחדרת השתל בשל ההבדל בין המקדחה הסופית לשתל, כמו גם הפרופיל הגלילי של השתל; עם זאת, קושי ראשוני זה מנורמל במהירות ברגע שהשתל חודר לעצם קליפת המוח הראשונית.
   4. סיים את החדרת השתל לפני שהוא עובר לחלוטין את עצם קליפת המוח שבה הוא מוכנס, כלומר, את הפנים המדיאלי שטוח של השוקה.
      הערה: ברגע האחרון של החדרת השתל, חשוב להשאיר את השתל מעט מחוץ לעצם קליפת המוח או לרמה עם עצם קליפת המוח שבה הוא מוחדר, כלומר הפנים המדיאליות השטוחות של השוקה, כדי להבטיח יציבות ראשונית (איור 6).
4. סגירת פצע
   1. תפרו את גבולות רקמת השריר באמצעות תפרים פנימיים פשוטים באמצעות תפר סינתטי 4/0 מונופילמנט (גליקונט) (איור 7).
   2. בצעו סגירת עור עם תפר תוך-עורי באמצעות תפר סינתטי 4/0 מונופילמנט (גליקונט) (איור 7).

4. סריקת מיקרו-CT

1. לאחר סיום הניתוח ועדיין בהרדמה כללית, יש לבצע סריקת מיקרו-CT כדי לוודא מיקום נכון של השתל.
2. הוציאו את החולדה ממיטת הניתוח והניחו אותה על מיטת הסריקה. אתר את הרגל המנותחת באמצעות מצב סריקה חיה micro-CT ומרכז את שדה הראייה על השתל.
   הערה: פרמטרי הרכישה המומלצים הם שדה ראייה של 5 מ"מ, רזולוציה מרחבית של 0.0001 מ"מ³, 50 kV, 200 μA וזמן רכישה של 3 דקות.
3. לאחר רכישת הסריקה, אשר את המרחק הנכון בין האספקט הפרוקסימלי של השתל לבין פני השטח של הרמה הטיביאלית, על פי שלב 5.2.1.
   הערה: ערך זה יועיל לסטנדרטיזציה של הטכניקה (איור 8).

5. טיפול לאחר הניתוח

1. לאחר רכישת ההדמיה, יש להחזיר את החולדה לכלוב ולעקוב אחריה עד להחלמה מלאה.
   הערה: פעולה זו נמשכת כ-5-10 דקות, בהתאם לדגם בעל החיים. חולדות סוכרתיות צפויות להישאר מורדמות זמן רב יותר וזמן החלמה ארוך יותר בשל השינויים המטבוליים הקשורים לסוכרת.
2. מתן buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) כל 6-8 שעות meloxicam (5 מ"ג / ק"ג) כל 24 שעות, תת עורית, עד 72 שעות.
3. זמן הסרת תפרים
   1. יש לבדוק את פצע הניתוח מדי יום לאיתור זיהום, שלמות התפרים או בעיות אחרות, ולהסיר את שאריות התפרים, במידת הצורך, 15 יום לאחר הניתוח.

6. המתת חסד

1. הרדימו את בעלי החיים באמצעות תא_CO2 , על פי הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), עם שיעור מילוי_CO2 של 30%-70% מנפח התא לדקה לאחר זמן ההשתלה (4 שבועות או 12 שבועות).

7. ניתוח לאחר ניתוח

1. עבור שני המודלים (אוסטאופורוזיס וסוכרת), להסיר את השוקה על ידי disarticulation לאחר המתת חסד לניתוח נוסף.
   הערה: לגבי ניתוח מיקרו-CT, הנתונים אפשרו חישוב מגע בין שתל עצם (BIC). רכישת ה-CT בוצעה באמצעות הפרמטרים שתוארו לעיל, וניתוח ה-BIC בוצע על ידי חלוקת אזור העצם (מ"מ²) באזור השתל (מ"מ²) המחושב באזור קליפת המוח, תוך התאמת פרוטוקול שכבר תואר בספרות¹⁸. תמונות מייצגות מוצגות עבור כל מודל, אוסטאופורוזיס (איור 9) וסוכרת (איור 10).

תוצאות

שלב כירורגי
חשוב להזכיר כי שני המודלים של בעלי חיים המשמשים במחקר זה מציגים אילוצים מסוימים עקב מחלות המושרות. אילוצים אלה לגבי מניפולציה של רקמות קשות ורכות באים לידי ביטוי במהלך ההליך הכירורגי.

במודל הסוכרתי, החולדה גדולה יותר, מה שמקשה על יי?...

Discussion

למרות שהחולדה היא מודל נפוץ לחקר אוסאואינטגרציה, חשוב להגדיר ולתאר טכניקה כירורגית הניתנת לשחזור להנחת שתלים כראוי. טכניקה כזו יכולה לשמש מדריך לקהילה המדעית. יתר על כן, העובדה כי מחלות מסוימות, כגון אוסטאופורוזיס וסוכרת, לשנות את חילוף החומרים עצם מרמז על דרישות חזקות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G needles+A2:C30	Terumo	NN-2238R
4/0 monofilament synthetic resorbable suture	Braun ( MonoSyn)
5 mL, 10 mL syringes	Braun	4617100V-02 4606051V
Adson forceps	Antão Medical	Ref: A586
BBDR ( Biobreeding Diabetes Resistant ) Sprague Dawley Rats	Janvier Labs
Betadine	Mylan
Buprecare	Animalcare (UK)
Castroviejo Caliper 0-40 mm 15 cm angled	UL AMIN Industries
Castroviejo Needle Holder	Antão Medical	Ref: AM1702
Dental surgery scissors curved and straight	Antão Medical	AMA603 / AMA600
Electric shaver	Oster Pro 3000i	34264482227
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T	Ref: 11150-10
Gauze pads	COVIDIEN	441001
Glucometer	Menarini (Italy)
Helicoidal Drill / OSTEO-PIN DRILL Ø1.6 mm	soadco	Ref. OS-8001
Implants / SCREW OSTEO-PIN Ø1.8 x 2.0 mm	soadco	Ref. OS-3
Isoflo	Le Vet Pharma (Netherlands)
Lance pilot drill / Lanceolate Drill (DS)	soadco	Ref. 10 02 01 T
Latex gloves - Surgical gloves sterile	Hartmann	Ref: 9426495
Lucas Surgical Curette	Antão Medical	Ref: AMA940-3
Metacam	Boehringer Ingelheim(Germany)
Micro forceps straight	nopa	Ref: AB 542/12
Micro-CT scan( Quantum Fx microCT )	Perkin Elmer (US)
Osteoporotic Sprague Dawley females Rats	Janvier Labs
Periosteal elevator -  Molt 2-4	Antão Medical	Ref: A1564
Physiologic solution for Irrigation	Hygitech	Ref:10238
Scalpel Blade Carbon Steel 15C	Razor Med	Ref: 02846
Sterile Gauze Swabs	Alledental	Ref: 270712
Sterile Irrigation system	Hygitech	Ref:HY1-110001D
Sterile towels (1 piece per animal)	Dinarex	4410
Surgical contra-angle handpiece	W&H	Ref: WS-75 LED G
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 08877
Surgical contra-angle handpiece	W&H	SN 01309
Surgical Electric Motor	WH Implantmed Type: SI-1023	Ref: 30288000
Surgical scalpel handle	AsaDental	Ref: 0350-3
Towel clamps	Xelpov surgical	AF-773-11
Ultrasonic device	J.P. Selecta, Abrera, Spain