一种基于活细胞图像的机器学习策略，用于监测多能干细胞分化

摘要

目前的多能干细胞 （PSC） 到功能细胞分化系统目前受到严重的线间和批次间差异问题的阻碍。在这里，以心脏分化为主要示例，我们提出了一种基于基于图像的机器学习智能监测和调节 PSC 分化过程的协议。

摘要

多能干细胞 （PSC） 技术已广泛用于药物发现、疾病建模和再生医学。然而，可用的 PSC 到功能细胞分化系统受到严重的线间和批次间差异问题的阻碍。因此，实时精确控制细胞分化非常重要。在该协议中，我们描述了一种非侵入性和智能策略，它通过使用基于明场图像的机器学习来克服细胞分化的可变性。以 PSC 到心肌细胞的分化为例，该方法为控制初始 PSC 状态、分化条件下的早期评估和干预以及消除错误分化的细胞污染提供了详细信息，共同实现了从 PSC 到功能细胞的始终如一的高质量分化。原则上，该策略可以扩展到其他具有多个步骤的细胞分化或重编程系统，以支持细胞制造，以及进一步了解细胞命运转换过程中的机制。

引言

多能干细胞 （PSC） 具有在体外分化成多种类型细胞的显着能力。这些分化的功能细胞可用于细胞治疗、疾病建模和药物开发，所有这些都对研究或临床应用很有价值 ^1,2,3。例如，已经开发了多种方法将 PSC 区分为心肌细胞 （CM）4,5,6,7。这些 CM 可应用于药物的心脏毒性测试、心脏病建模和细胞移植 8,9,10,11。

然而，从 PSC 到终末分化细胞的转化是一个逐步的过程，分化过程中的多次扰动可能导致细胞命运不同。PSC 系的不同遗传背景和表观遗传标记会影响分化为特定谱系的潜力 12,13,14,15;

研究方案

1. 细胞分化和表征

1. 培养试剂和培养板的制备
   1. 向 48 mL 基础培养基中加入 2 mL 补充剂和 0.2% 青霉素-链霉素，制备 PSC 培养基。将补充剂分装并储存在 -20 °C。 将此培养基在 4 °C 下储存长达 4 周。
   2. 向 500 mL 基础培养基中加入 1 mL 补充剂和 0.2% 青霉素-链霉素，制备 PSC 制备培养基。使用时，预热培养基以供一次性使用，并将培养基在 4 °C 下储存长达 3 周。
   3. 通过在 RPMI 1640 中加入 1x B27 补充剂（不含胰岛素）和 1% 青霉素-链霉素来制备 CM 分化培养基。通过将 1x B27 补充剂和 1% 青霉素-链霉素添加到 RPMI 1640 中来制备 CM 维持培养基。将这两种培养基在 4 °C 下储存 2 周。
   4. 将 Matrigel 浸入冰中，并在 4 °C 下保持过夜。确保 Matrigel 完全解冻;然后，分装成 1 mL 等分试样，储存在 -80 °C 以备后用，并在 4 °C 下将 1 mL Matrigel 加入 49 mL DMEM/F12 中，以制备 Matrigel 工作溶液。在 6 孔培养板的每孔中加入 850 μL 这种 Matrigel 工作溶液，并将板在 37 °C 下孵育至少 30 分钟。对于用于 CM 分化的 96 孔培养....

讨论

在这里，我们描述了一个详细的方案，以克服当前 PSC 应用和翻译中的主要问题之一——细胞分化的可变性。通过利用活细胞明场成像和 ML，我们迭代优化了 PSC 分化，以实现跨细胞系和批次的一致高效率。然而，在上述分化过程中，方案中的几个关键步骤对分化是否成功具有决定性影响。由于 PSC 阶段和 I 期的细胞状态至关重要，因此实验人员需要特别注意早期细胞形态.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Diluted digests were used for CPC and CM digestion
4% Paraformaldehyde in PBS	KeyGEN BioTECH	KGIHC016
6-well Cell Culture Plate	NEST	703001
96-well Cell Culture Plate	NEST	701001
B27 Supplement	Gibco	17504044
B27 Supplement Minus Insulin	Gibco	A1895601
Bovine serum albumin (BSA)	GPC BIOTECH	AA904-100G
Celldiscoverer 7	Zeiss		Instruments used to take bright-field images throughout differentiation and final cTnT images
CHIR99021	Selleck	S1263
DMEM/F12	Gibco	12634010
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo	A-21202	Secondary Antibody
FACSAria III	BD Biosciences		Flow cytometry sorter
Fetal Bovine Serum (FBS)	VISTECH	SE100-B
Hoechst 33342	YEASEN	40732ES03
Human Pluripotent Stem Cell Chemical-defined Medium	Cauliscell Inc	400105	Basal medium of PSC preparation medium
iPS-18	TaKaRa	Y00300
iPS-B1	Cellapy	CA4025106
iPS-F	Nuwacell	RC01001-B
iPS-M	Nuwacell	RC01001-A
IWR1-1-endo	Selleck	S7086	IWR1
Jupyter Notebook	N/A	Version 6.4.0	https://jupyter.org/
MATLAB	MathWorks	Version R2020a	Software for scientific computation and image annotation
Matrigel Matrix	Corning	354230	Matrigel
Mouse monoclonal IgG1 anti-cTnT	Thermo	MA5-12960	cTnT primary antibody
Normal Donkey Serum	Jackson	017-000-121
ORCA-Flash 4.0 V3 digital CMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU	The digital camera assembled on Celldiscoverer7
PBS	NEB	21-040-CVR
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Pluripotency Growth Mater 1 basal medium	Cellapy	CA1007500-1	Basal medium of PSC culture medium
Pluripotency Growth Mater 1 supplement	Cellapy	CA1007500-2	Supplement of PSC culture medium
Prism	Graphpad	Version 8/9	Statistical software for statistical analysis and plotting
Python	N/A	version 3.6	Python 3 environment for scientific computation, with packages pytorch (1.9.0), numpy, scipy, pandas, visdom, scikit-learn, scikit-image, opencv-python, and matplotlib software for scientific computation and image annotation.
RPMI 1640	Gibco	11875176
Supplement hPSC-CDM (500x)	Cauliscell Inc	00015	Supplement of PSC preparation medium
TiE	Nikon		An inverted fluorescence microscope (with modification) for region-selevtive purification
Triton X-100	Amresco	9002-93-1
Versene Solution	Thermo	15040066	EDTA solution for PSC digestion
Y27632	Selleck	S6390
Zen	Zeiss	Version 3.1	A supporting software of Celldiscoverer7 for  image acquisition, processing and analysis