Uma estratégia de aprendizado de máquina baseada em imagem de células vivas para monitorar a diferenciação de células-tronco pluripotentes

Resumo

Os sistemas de diferenciação de células-tronco pluripotentes (PSC) para células funcionais disponíveis são atualmente impedidos por problemas de variabilidade severa linha a linha e lote a lote. Aqui, usando a diferenciação cardíaca como exemplo principal, apresentamos um protocolo para monitorar e modular de forma inteligente o processo de diferenciação de CEP com base em aprendizado de máquina baseado em imagem.

Resumo

As tecnologias de células-tronco pluripotentes (PSC) têm sido amplamente utilizadas na descoberta de medicamentos, modelagem de doenças e medicina regenerativa. No entanto, os sistemas de diferenciação PSC para células funcionais disponíveis são impedidos por problemas de variabilidade severa linha a linha e lote a lote. O controle preciso da diferenciação celular em tempo real é, portanto, importante. Neste protocolo, descrevemos uma estratégia não invasiva e inteligente que supera a variabilidade na diferenciação celular usando aprendizado de máquina baseado em imagem de campo claro. Tomando como exemplo a diferenciação de CEP para cardiomiócitos, esta metodologia fornece informações detalhadas para o controle do estado inicial de CEP, avaliação e intervenção precoces em condições de diferenciação e eliminação da contaminação celular indiferenciada, realizando juntos uma diferenciação consistente de alta qualidade de CEPs para células funcionais. Em princípio, essa estratégia pode ser estendida a outros sistemas de diferenciação ou reprogramação celular com várias etapas para apoiar a fabricação de células, bem como para aprofundar nossa compreensão dos mecanismos durante a conversão do destino celular.

Introdução

As células-tronco pluripotentes (PSCs) possuem a notável capacidade de se diferenciar em muitos tipos de células in vitro. Essas células funcionais diferenciadas podem ser usadas para terapia celular, modelagem de doenças e desenvolvimento de medicamentos, todos valiosos para pesquisas ou aplicações clínicas ^1,2,3. Por exemplo, uma variedade de métodos foi desenvolvida para diferenciar as CEPs em cardiomiócitos (MCs)4,5,6,7.

Protocolo

1. Diferenciação e caracterização celular

1. Preparação de reagentes de cultura e placas de cultura
   1. Prepare o meio de cultura PSC adicionando 2 mL de suplemento e 0,2% de penicilina-estreptomicina a 48 mL de meio basal. Aliquotar e conservar o suplemento a -20 °C. Conservar este meio a 4 °C durante um máximo de 4 semanas.
   2. Prepare o meio de preparação PSC adicionando 1 mL de suplemento e 0,2% de penicilina-estreptomicina a 500 mL de meio basal. Ao usar, pré-aqueça o meio para uso único e armazene-o a 4 ° C por até 3 semanas.
   3. Prepare o meio de diferenciação do CM adicionando 1x ....

Discussão

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para superar um dos principais problemas na aplicação e tradução atuais do PSC - a variabilidade na diferenciação celular. Ao aproveitar a imagem de campo claro de células vivas e ML, otimizamos iterativamente a diferenciação de PSC para alcançar uma eficiência consistentemente alta em linhas e lotes celulares. No entanto, no processo de diferenciação acima, várias etapas críticas no protocolo têm uma influência decisiva sobre se .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Diluted digests were used for CPC and CM digestion
4% Paraformaldehyde in PBS	KeyGEN BioTECH	KGIHC016
6-well Cell Culture Plate	NEST	703001
96-well Cell Culture Plate	NEST	701001
B27 Supplement	Gibco	17504044
B27 Supplement Minus Insulin	Gibco	A1895601
Bovine serum albumin (BSA)	GPC BIOTECH	AA904-100G
Celldiscoverer 7	Zeiss		Instruments used to take bright-field images throughout differentiation and final cTnT images
CHIR99021	Selleck	S1263
DMEM/F12	Gibco	12634010
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo	A-21202	Secondary Antibody
FACSAria III	BD Biosciences		Flow cytometry sorter
Fetal Bovine Serum (FBS)	VISTECH	SE100-B
Hoechst 33342	YEASEN	40732ES03
Human Pluripotent Stem Cell Chemical-defined Medium	Cauliscell Inc	400105	Basal medium of PSC preparation medium
iPS-18	TaKaRa	Y00300
iPS-B1	Cellapy	CA4025106
iPS-F	Nuwacell	RC01001-B
iPS-M	Nuwacell	RC01001-A
IWR1-1-endo	Selleck	S7086	IWR1
Jupyter Notebook	N/A	Version 6.4.0	https://jupyter.org/
MATLAB	MathWorks	Version R2020a	Software for scientific computation and image annotation
Matrigel Matrix	Corning	354230	Matrigel
Mouse monoclonal IgG1 anti-cTnT	Thermo	MA5-12960	cTnT primary antibody
Normal Donkey Serum	Jackson	017-000-121
ORCA-Flash 4.0 V3 digital CMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU	The digital camera assembled on Celldiscoverer7
PBS	NEB	21-040-CVR
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Pluripotency Growth Mater 1 basal medium	Cellapy	CA1007500-1	Basal medium of PSC culture medium
Pluripotency Growth Mater 1 supplement	Cellapy	CA1007500-2	Supplement of PSC culture medium
Prism	Graphpad	Version 8/9	Statistical software for statistical analysis and plotting
Python	N/A	version 3.6	Python 3 environment for scientific computation, with packages pytorch (1.9.0), numpy, scipy, pandas, visdom, scikit-learn, scikit-image, opencv-python, and matplotlib software for scientific computation and image annotation.
RPMI 1640	Gibco	11875176
Supplement hPSC-CDM (500x)	Cauliscell Inc	00015	Supplement of PSC preparation medium
TiE	Nikon		An inverted fluorescence microscope (with modification) for region-selevtive purification
Triton X-100	Amresco	9002-93-1
Versene Solution	Thermo	15040066	EDTA solution for PSC digestion
Y27632	Selleck	S6390
Zen	Zeiss	Version 3.1	A supporting software of Celldiscoverer7 for  image acquisition, processing and analysis