Стратегия машинного обучения на основе изображений живых клеток для мониторинга дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток

Резюме

Доступные системы дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) в функциональные клетки в настоящее время затруднены из-за проблем серьезной вариабельности от линии к линии и от партии к партии. Здесь, используя кардиальную дифференцировку в качестве основного примера, мы представляем протокол для интеллектуального мониторинга и модуляции процесса дифференцировки ПСК на основе машинного обучения на основе изображений.

Аннотация

Технологии плюрипотентных стволовых клеток (ПСК) широко используются в разработке лекарств, моделировании заболеваний и регенеративной медицине. Тем не менее, существующие системы дифференцировки ПСХ в функциональные клетки затруднены проблемами серьезной вариабельности от линии к линии и от партии к партии. Поэтому важен точный контроль дифференцировки клеток в режиме реального времени. В этом протоколе мы описываем неинвазивную и интеллектуальную стратегию, которая преодолевает вариабельность дифференцировки клеток с помощью машинного обучения на основе изображений в ярком поле. Взяв в качестве примера дифференцировку ПСХ в кардиомиоциты, данная методология предоставляет подробную информацию для контроля исходного состояния ПСК, ранней оценки и вмешательства в условиях дифференцировки, а также устранения недифференцированной клеточной контаминации, что в совокупности обеспечивает стабильно высокое качество дифференцировки от ПСК к функциональным клеткам. В принципе, эта стратегия может быть распространена на другие системы дифференцировки или перепрограммирования клеток с несколькими ступенями для поддержки производства клеток, а также для углубления нашего понимания механизмов трансформации клеточной судьбы.

Введение

Плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) обладают замечательной способностью дифференцироваться во многие типы клеток in vitro. Эти дифференцированные функциональные клетки могут быть использованы для клеточной терапии, моделирования заболеваний и разработки лекарств, и все они представляют ценность для исследований или клинического применения ^1,2,3. Например, были разработаны различные методы дифференцировки ПСК в кардиомиоциты (КМ)4,5,6,7.<....

протокол

1. Дифференцировка и характеристика клеток

1. Приготовление культуральных реактивов и культуральных планшетов
   1. Питательную среду ПСК приготовить, добавив 2 мл добавки и 0,2% пенициллин-стрептомицина к 48 мл базальной среды. Аликвотируйте и храните добавку при температуре -20 °C. Храните эту среду при температуре 4 °C до 4 недель.
   2. Приготовьте среду для приготовления ПСК путем добавления 1 мл добавки и 0,2% пенициллин-стрептомицина на 500 мл базальной среды. При использовании подогрейте среду для одноразового использования и храните среду при температуре 4 °C до 3 недель.
   3. Пригото....

Результаты

На основе визуализации в светлом поле и машинного обучения можно интеллектуально контролировать и оптимизировать общий процесс дифференциации. На этапе ПСК мы разработали ML-модель, которая могла бы предсказать окончательную эффективность дифференцировки в соответ.......

Обсуждение

В этой статье мы подробно описали протокол для преодоления одной из основных проблем в современном применении и трансляции ПСК — вариабельности дифференцировки клеток. Используя визуализацию в светлом поле живых клеток и машинное обучение, мы итеративно оптимизиро.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Diluted digests were used for CPC and CM digestion
4% Paraformaldehyde in PBS	KeyGEN BioTECH	KGIHC016
6-well Cell Culture Plate	NEST	703001
96-well Cell Culture Plate	NEST	701001
B27 Supplement	Gibco	17504044
B27 Supplement Minus Insulin	Gibco	A1895601
Bovine serum albumin (BSA)	GPC BIOTECH	AA904-100G
Celldiscoverer 7	Zeiss		Instruments used to take bright-field images throughout differentiation and final cTnT images
CHIR99021	Selleck	S1263
DMEM/F12	Gibco	12634010
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo	A-21202	Secondary Antibody
FACSAria III	BD Biosciences		Flow cytometry sorter
Fetal Bovine Serum (FBS)	VISTECH	SE100-B
Hoechst 33342	YEASEN	40732ES03
Human Pluripotent Stem Cell Chemical-defined Medium	Cauliscell Inc	400105	Basal medium of PSC preparation medium
iPS-18	TaKaRa	Y00300
iPS-B1	Cellapy	CA4025106
iPS-F	Nuwacell	RC01001-B
iPS-M	Nuwacell	RC01001-A
IWR1-1-endo	Selleck	S7086	IWR1
Jupyter Notebook	N/A	Version 6.4.0	https://jupyter.org/
MATLAB	MathWorks	Version R2020a	Software for scientific computation and image annotation
Matrigel Matrix	Corning	354230	Matrigel
Mouse monoclonal IgG1 anti-cTnT	Thermo	MA5-12960	cTnT primary antibody
Normal Donkey Serum	Jackson	017-000-121
ORCA-Flash 4.0 V3 digital CMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU	The digital camera assembled on Celldiscoverer7
PBS	NEB	21-040-CVR
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Pluripotency Growth Mater 1 basal medium	Cellapy	CA1007500-1	Basal medium of PSC culture medium
Pluripotency Growth Mater 1 supplement	Cellapy	CA1007500-2	Supplement of PSC culture medium
Prism	Graphpad	Version 8/9	Statistical software for statistical analysis and plotting
Python	N/A	version 3.6	Python 3 environment for scientific computation, with packages pytorch (1.9.0), numpy, scipy, pandas, visdom, scikit-learn, scikit-image, opencv-python, and matplotlib software for scientific computation and image annotation.
RPMI 1640	Gibco	11875176
Supplement hPSC-CDM (500x)	Cauliscell Inc	00015	Supplement of PSC preparation medium
TiE	Nikon		An inverted fluorescence microscope (with modification) for region-selevtive purification
Triton X-100	Amresco	9002-93-1
Versene Solution	Thermo	15040066	EDTA solution for PSC digestion
Y27632	Selleck	S6390
Zen	Zeiss	Version 3.1	A supporting software of Celldiscoverer7 for  image acquisition, processing and analysis