Une stratégie d’apprentissage automatique basée sur l’image de cellules vivantes pour surveiller la différenciation des cellules souches pluripotentes

Résumé

Les systèmes de différenciation des cellules souches pluripotentes (CSP) disponibles en cellules fonctionnelles sont actuellement entravés par des problèmes de variabilité sévère d’une ligne à l’autre et d’un lot à l’autre. Ici, en utilisant la différenciation cardiaque comme exemple principal, nous présentons un protocole pour surveiller et moduler intelligemment le processus de différenciation des CSP basé sur l’apprentissage automatique basé sur l’image.

Résumé

Les technologies de cellules souches pluripotentes (CSP) ont été largement utilisées dans la découverte de médicaments, la modélisation de maladies et la médecine régénérative. Cependant, les systèmes de différenciation cellulaire fonctionnelle PSC disponibles sont entravés par des problèmes de variabilité sévère d’une ligne à l’autre et d’un lot à l’autre. Il est donc important de contrôler précisément la différenciation cellulaire en temps réel. Dans ce protocole, nous décrivons une stratégie non invasive et intelligente qui surmonte la variabilité de la différenciation cellulaire en utilisant l’apprentissage automatique basé sur l’image en champ clair. Si l’on prend l’exemple de la différenciation des CSP en cardiomyocytes, cette méthodologie fournit des informations détaillées pour le contrôle de l’état initial des CSP, l’évaluation et l’intervention précoces dans les conditions de différenciation, et l’élimination de la contamination cellulaire indifférenciée, tout en réalisant une différenciation de haute qualité et constante des CSP en cellules fonctionnelles. En principe, cette stratégie peut être étendue à d’autres systèmes de différenciation ou de reprogrammation cellulaire avec plusieurs étapes pour soutenir la fabrication des cellules, ainsi que pour approfondir notre compréhension des mécanismes lors de la conversion du destin cellulaire.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes (CSP) possèdent la remarquable capacité de se différencier en de nombreux types de cellules in vitro. Ces cellules fonctionnelles différenciées pourraient être utilisées pour la thérapie cellulaire, la modélisation de maladies et le développement de médicaments, toutes précieuses pour la recherche ou les applications cliniques ^1,2,3. Par exemple, diverses méthodes ont été développées pour différencier les CSP en cardiomyocytes (CM)4,5,6,7.....

Protocole

1. Différenciation et caractérisation cellulaires

1. Préparation des réactifs de culture et des plaques de culture
   1. Préparez le milieu de culture PSC en ajoutant 2 mL de supplément et 0,2 % de pénicilline-streptomycine à 48 mL de milieu basal. Aliquote et conservez le supplément à -20 °C. Conservez ce milieu à 4 °C jusqu’à 4 semaines.
   2. Préparez le milieu de préparation PSC en ajoutant 1 mL de supplément et 0,2 % de pénicilline-streptomycine à 500 mL de milieu basal. Lors de l’utilisation, préchauffez le milieu pour une utilisation unique et conservez-le à 4 °C jusqu’à 3 semaines.

Discussion

Ici, nous avons décrit un protocole détaillé pour surmonter l’un des principaux problèmes de l’application et de la traduction actuelles de la CSP : la variabilité de la différenciation cellulaire. En exploitant l’imagerie en fond clair de cellules vivantes et le ML, nous avons optimisé de manière itérative la différenciation des CSP pour obtenir une efficacité élevée et constante entre les lignées cellulaires et les lots. Cependant, dans le processus de différenciat.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Diluted digests were used for CPC and CM digestion
4% Paraformaldehyde in PBS	KeyGEN BioTECH	KGIHC016
6-well Cell Culture Plate	NEST	703001
96-well Cell Culture Plate	NEST	701001
B27 Supplement	Gibco	17504044
B27 Supplement Minus Insulin	Gibco	A1895601
Bovine serum albumin (BSA)	GPC BIOTECH	AA904-100G
Celldiscoverer 7	Zeiss		Instruments used to take bright-field images throughout differentiation and final cTnT images
CHIR99021	Selleck	S1263
DMEM/F12	Gibco	12634010
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo	A-21202	Secondary Antibody
FACSAria III	BD Biosciences		Flow cytometry sorter
Fetal Bovine Serum (FBS)	VISTECH	SE100-B
Hoechst 33342	YEASEN	40732ES03
Human Pluripotent Stem Cell Chemical-defined Medium	Cauliscell Inc	400105	Basal medium of PSC preparation medium
iPS-18	TaKaRa	Y00300
iPS-B1	Cellapy	CA4025106
iPS-F	Nuwacell	RC01001-B
iPS-M	Nuwacell	RC01001-A
IWR1-1-endo	Selleck	S7086	IWR1
Jupyter Notebook	N/A	Version 6.4.0	https://jupyter.org/
MATLAB	MathWorks	Version R2020a	Software for scientific computation and image annotation
Matrigel Matrix	Corning	354230	Matrigel
Mouse monoclonal IgG1 anti-cTnT	Thermo	MA5-12960	cTnT primary antibody
Normal Donkey Serum	Jackson	017-000-121
ORCA-Flash 4.0 V3 digital CMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU	The digital camera assembled on Celldiscoverer7
PBS	NEB	21-040-CVR
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Pluripotency Growth Mater 1 basal medium	Cellapy	CA1007500-1	Basal medium of PSC culture medium
Pluripotency Growth Mater 1 supplement	Cellapy	CA1007500-2	Supplement of PSC culture medium
Prism	Graphpad	Version 8/9	Statistical software for statistical analysis and plotting
Python	N/A	version 3.6	Python 3 environment for scientific computation, with packages pytorch (1.9.0), numpy, scipy, pandas, visdom, scikit-learn, scikit-image, opencv-python, and matplotlib software for scientific computation and image annotation.
RPMI 1640	Gibco	11875176
Supplement hPSC-CDM (500x)	Cauliscell Inc	00015	Supplement of PSC preparation medium
TiE	Nikon		An inverted fluorescence microscope (with modification) for region-selevtive purification
Triton X-100	Amresco	9002-93-1
Versene Solution	Thermo	15040066	EDTA solution for PSC digestion
Y27632	Selleck	S6390
Zen	Zeiss	Version 3.1	A supporting software of Celldiscoverer7 for  image acquisition, processing and analysis