Pluripotent Kök Hücre Farklılaşmasını İzlemek için Canlı Hücre Görüntü Tabanlı Makine Öğrenimi Stratejisi

Özet

Mevcut pluripotent kök hücre (PSC)-fonksiyonel hücre farklılaşma sistemleri şu anda ciddi hattan hatta ve partiden partiye değişkenlik sorunları tarafından engellenmektedir. Burada, kardiyak farklılaşmayı ana örnek olarak kullanarak, görüntü tabanlı makine öğrenimine dayalı PSC farklılaşma sürecini akıllıca izlemek ve modüle etmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Pluripotent kök hücre (PSC) teknolojileri, ilaç keşfi, hastalık modellemesi ve rejeneratif tıpta yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, mevcut PSC'den fonksiyona hücre farklılaştırma sistemleri, ciddi hattan hatta ve partiden partiye değişkenlik sorunları tarafından engellenmektedir. Bu nedenle hücre farklılaşmasının gerçek zamanlı olarak hassas kontrolü önemlidir. Bu protokolde, parlak alan görüntü tabanlı makine öğrenimi kullanarak hücre farklılaşmasındaki değişkenliğin üstesinden gelen, invaziv olmayan ve akıllı bir strateji açıklıyoruz. PSC'den kardiyomiyosite farklılaşmayı örnek olarak alan bu metodoloji, ilk PSC durumunun kontrolü, farklılaşma koşullarına erken değerlendirme ve müdahale ve yanlış farklılaşmış hücre kontaminasyonunun ortadan kaldırılması için ayrıntılı bilgi sağlar ve birlikte PSC'lerden fonksiyonel hücrelere sürekli olarak yüksek kaliteli farklılaşmayı gerçekleştirir. Prensip olarak, bu strateji, hücre üretimini desteklemek ve hücre kaderi dönüşümü sırasındaki mekanizmaları daha iyi anlamamızı sağlamak için çok adımlı diğer hücre farklılaşması veya yeniden programlama sistemlerine genişletilebilir.

Giriş

Pluripotent kök hücreler (PSC'ler), in vitro olarak birçok hücre tipine farklılaşma konusunda olağanüstü bir yeteneğe sahiptir. Bu farklılaşmış fonksiyonel hücreler, tümü araştırma veya klinik uygulamalar için değerli olan hücre tedavisi, hastalık modellemesi ve ilaç geliştirme için kullanılabilir ^1,2,3. Örneğin, PSC'leri kardiyomiyositlere (CM'ler) ayırmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir4,5,6,7. Bu CM'ler, ....

Protokol

1. Hücre farklılaşması ve karakterizasyonu

1. Kültür reaktiflerinin ve kültür plakalarının hazırlanması
   1. 48 mL bazal ortama 2 mL takviye ve% 0.2 Penisilin-Streptomisin ekleyerek PSC kültür ortamını hazırlayın. Eki alın ve -20 °C'de saklayın. Bu ortamı 4 °C'de 4 haftaya kadar saklayın.
   2. 500 mL bazal ortama 1 mL takviye ve% 0.2 Penisilin-Streptomisin ekleyerek PSC hazırlama ortamını hazırlayın. Kullanırken, ortamı bir kerelik kullanım için önceden ısıtın ve ortamı 4 °C'de 3 haftaya kadar saklayın.
   3. RPMI 1640'a 1x B27 takviyesi eksi insülin ve% 1 Penisilin-Streptomisin ekleyerek CM ....

Tartışmalar

Burada, mevcut PSC uygulaması ve çevirisindeki en büyük sorunlardan biri olan hücre farklılaşmasındaki değişkenliğin üstesinden gelmek için ayrıntılı bir protokol tanımladık. Canlı hücreli parlak alan görüntüleme ve makine öğreniminden yararlanarak, hücre hatları ve partiler arasında tutarlı bir şekilde yüksek verimlilik elde etmek için PSC farklılaşmasını yinelemeli olarak optimize ettik. Bununla birlikte, yukarıdaki farklılaşma sürecinde, protoko.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Diluted digests were used for CPC and CM digestion
4% Paraformaldehyde in PBS	KeyGEN BioTECH	KGIHC016
6-well Cell Culture Plate	NEST	703001
96-well Cell Culture Plate	NEST	701001
B27 Supplement	Gibco	17504044
B27 Supplement Minus Insulin	Gibco	A1895601
Bovine serum albumin (BSA)	GPC BIOTECH	AA904-100G
Celldiscoverer 7	Zeiss		Instruments used to take bright-field images throughout differentiation and final cTnT images
CHIR99021	Selleck	S1263
DMEM/F12	Gibco	12634010
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo	A-21202	Secondary Antibody
FACSAria III	BD Biosciences		Flow cytometry sorter
Fetal Bovine Serum (FBS)	VISTECH	SE100-B
Hoechst 33342	YEASEN	40732ES03
Human Pluripotent Stem Cell Chemical-defined Medium	Cauliscell Inc	400105	Basal medium of PSC preparation medium
iPS-18	TaKaRa	Y00300
iPS-B1	Cellapy	CA4025106
iPS-F	Nuwacell	RC01001-B
iPS-M	Nuwacell	RC01001-A
IWR1-1-endo	Selleck	S7086	IWR1
Jupyter Notebook	N/A	Version 6.4.0	https://jupyter.org/
MATLAB	MathWorks	Version R2020a	Software for scientific computation and image annotation
Matrigel Matrix	Corning	354230	Matrigel
Mouse monoclonal IgG1 anti-cTnT	Thermo	MA5-12960	cTnT primary antibody
Normal Donkey Serum	Jackson	017-000-121
ORCA-Flash 4.0 V3 digital CMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU	The digital camera assembled on Celldiscoverer7
PBS	NEB	21-040-CVR
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Pluripotency Growth Mater 1 basal medium	Cellapy	CA1007500-1	Basal medium of PSC culture medium
Pluripotency Growth Mater 1 supplement	Cellapy	CA1007500-2	Supplement of PSC culture medium
Prism	Graphpad	Version 8/9	Statistical software for statistical analysis and plotting
Python	N/A	version 3.6	Python 3 environment for scientific computation, with packages pytorch (1.9.0), numpy, scipy, pandas, visdom, scikit-learn, scikit-image, opencv-python, and matplotlib software for scientific computation and image annotation.
RPMI 1640	Gibco	11875176
Supplement hPSC-CDM (500x)	Cauliscell Inc	00015	Supplement of PSC preparation medium
TiE	Nikon		An inverted fluorescence microscope (with modification) for region-selevtive purification
Triton X-100	Amresco	9002-93-1
Versene Solution	Thermo	15040066	EDTA solution for PSC digestion
Y27632	Selleck	S6390
Zen	Zeiss	Version 3.1	A supporting software of Celldiscoverer7 for  image acquisition, processing and analysis