Una strategia di apprendimento automatico basata su immagini di cellule vive per monitorare la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti

Riepilogo

I sistemi di differenziazione da cellule staminali pluripotenti (PSC) a cellule funzionali sono attualmente ostacolati da problemi di grave variabilità da linea a linea e da lotto a lotto. Qui, utilizzando la differenziazione cardiaca come esempio principale, presentiamo un protocollo per monitorare e modulare in modo intelligente il processo di differenziazione della PSC basato sull'apprendimento automatico basato su immagini.

Abstract

Le tecnologie delle cellule staminali pluripotenti (PSC) sono state ampiamente utilizzate nella scoperta di farmaci, nella modellazione delle malattie e nella medicina rigenerativa. Tuttavia, i sistemi di differenziazione PSC-cellula funzionale disponibili sono ostacolati da problemi di grave variabilità da linea a linea e da lotto a lotto. È quindi importante un controllo preciso della differenziazione cellulare in tempo reale. In questo protocollo, descriviamo una strategia non invasiva e intelligente che supera la variabilità nella differenziazione cellulare utilizzando l'apprendimento automatico basato su immagini in campo chiaro. Prendendo come esempio la differenziazione da PSC a cardiomiociti, questa metodologia fornisce informazioni dettagliate per il controllo dello stato iniziale della PSC, la valutazione precoce e l'intervento in condizioni di differenziazione e l'eliminazione della contaminazione cellulare disdifferenziata, realizzando insieme una differenziazione costantemente di alta qualità dalle PSC alle cellule funzionali. In linea di principio, questa strategia può essere estesa ad altri sistemi di differenziazione o riprogrammazione cellulare con più passaggi per supportare la produzione cellulare, nonché per approfondire la nostra comprensione dei meccanismi durante la conversione del destino cellulare.

Introduzione

Le cellule staminali pluripotenti (PSC) possiedono la notevole capacità di differenziarsi in molti tipi di cellule in vitro. Queste cellule funzionali differenziate potrebbero essere utilizzate per la terapia cellulare, la modellazione di malattie e lo sviluppo di farmaci, tutti preziosi per la ricerca o le applicazioni cliniche ^1,2,3. Ad esempio, è stata sviluppata una varietà di metodi per differenziare le PSC in cardiomiociti (CM)4,5,6,7.

Protocollo

1. Differenziamento e caratterizzazione cellulare

1. Preparazione dei reagenti di coltura e delle piastre di coltura
   1. Preparare il terreno di coltura della PSC aggiungendo 2 mL di integratore e lo 0,2% di Penicillina-Streptomicina a 48 mL di terreno basale. Aliquotare e conservare l'integratore a -20 °C. Conservare questo terreno a 4 °C per un massimo di 4 settimane.
   2. Preparare il terreno di preparazione della PSC aggiungendo 1 ml di integratore e lo 0,2% di penicillina-streptomicina a 500 ml di terreno basale. Durante l'uso, preriscaldare il terreno per un utilizzo una tantum e conservare....

Discussione

Qui, abbiamo descritto un protocollo dettagliato per superare uno dei principali problemi nell'attuale applicazione e traduzione della PSC: la variabilità nella differenziazione cellulare. Sfruttando l'imaging in campo chiaro su cellule vive e il ML, abbiamo ottimizzato iterativamente la differenziazione PSC per ottenere un'efficienza costantemente elevata su linee cellulari e lotti. Tuttavia, nel processo di differenziazione di cui sopra, diversi passaggi critici del protocollo hanno u.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Diluted digests were used for CPC and CM digestion
4% Paraformaldehyde in PBS	KeyGEN BioTECH	KGIHC016
6-well Cell Culture Plate	NEST	703001
96-well Cell Culture Plate	NEST	701001
B27 Supplement	Gibco	17504044
B27 Supplement Minus Insulin	Gibco	A1895601
Bovine serum albumin (BSA)	GPC BIOTECH	AA904-100G
Celldiscoverer 7	Zeiss		Instruments used to take bright-field images throughout differentiation and final cTnT images
CHIR99021	Selleck	S1263
DMEM/F12	Gibco	12634010
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo	A-21202	Secondary Antibody
FACSAria III	BD Biosciences		Flow cytometry sorter
Fetal Bovine Serum (FBS)	VISTECH	SE100-B
Hoechst 33342	YEASEN	40732ES03
Human Pluripotent Stem Cell Chemical-defined Medium	Cauliscell Inc	400105	Basal medium of PSC preparation medium
iPS-18	TaKaRa	Y00300
iPS-B1	Cellapy	CA4025106
iPS-F	Nuwacell	RC01001-B
iPS-M	Nuwacell	RC01001-A
IWR1-1-endo	Selleck	S7086	IWR1
Jupyter Notebook	N/A	Version 6.4.0	https://jupyter.org/
MATLAB	MathWorks	Version R2020a	Software for scientific computation and image annotation
Matrigel Matrix	Corning	354230	Matrigel
Mouse monoclonal IgG1 anti-cTnT	Thermo	MA5-12960	cTnT primary antibody
Normal Donkey Serum	Jackson	017-000-121
ORCA-Flash 4.0 V3 digital CMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU	The digital camera assembled on Celldiscoverer7
PBS	NEB	21-040-CVR
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Pluripotency Growth Mater 1 basal medium	Cellapy	CA1007500-1	Basal medium of PSC culture medium
Pluripotency Growth Mater 1 supplement	Cellapy	CA1007500-2	Supplement of PSC culture medium
Prism	Graphpad	Version 8/9	Statistical software for statistical analysis and plotting
Python	N/A	version 3.6	Python 3 environment for scientific computation, with packages pytorch (1.9.0), numpy, scipy, pandas, visdom, scikit-learn, scikit-image, opencv-python, and matplotlib software for scientific computation and image annotation.
RPMI 1640	Gibco	11875176
Supplement hPSC-CDM (500x)	Cauliscell Inc	00015	Supplement of PSC preparation medium
TiE	Nikon		An inverted fluorescence microscope (with modification) for region-selevtive purification
Triton X-100	Amresco	9002-93-1
Versene Solution	Thermo	15040066	EDTA solution for PSC digestion
Y27632	Selleck	S6390
Zen	Zeiss	Version 3.1	A supporting software of Celldiscoverer7 for  image acquisition, processing and analysis