多能性幹細胞の分化を監視するための生細胞画像ベース機械学習戦略

要約

利用可能な多能性幹細胞(PSC)から機能細胞への分化システムは、現在、深刻なライン間およびバッチ間のばらつきの問題によって妨げられています。ここでは、心臓の分化を主な例として、画像ベースの機械学習に基づいてPSCの分化プロセスをインテリジェントに監視および調整するためのプロトコルを紹介します。

要約

多能性幹細胞(PSC)技術は、創薬、疾患モデリング、再生医療などで広く利用されています。しかし、利用可能なPSCから機能細胞への分化システムは、ライン間およびバッチ間の深刻な変動の問題によって妨げられています。そのため、細胞分化をリアルタイムで正確に制御することが重要です。このプロトコルでは、明視野画像ベースの機械学習を使用して細胞分化の変動を克服する非侵襲的でインテリジェントな戦略について説明します。PSCから心筋細胞への分化を例にとると、PSCの初期状態の制御、分化条件での早期評価と介入、分化ミスのある細胞汚染の排除など、詳細な情報を提供するとともに、PSCから機能細胞への高品質な分化を一貫して実現します。原則として、この戦略は、細胞製造をサポートするだけでなく、細胞運命変換中のメカニズムの理解を深めるために、複数のステップを持つ他の細胞分化またはリプログラミングシステムに拡張できます。

概要

多能性幹細胞(PSC)は、in vitroで多くの種類の細胞に分化する優れた能力を持っています。これらの分化した機能細胞は、細胞治療、疾患モデリング、および医薬品開発に利用できる可能性があり、これらはすべて研究や臨床応用に有用です^1,2,3。例えば、PSCを心筋細胞(CM)4,5,6,7に区別するための様々な方法が開発されてきた。これらのCMは、薬物の心毒性試験、心臓病のモデリング、および細胞移植^8,9,10,11に適用できます。

しかし、PSCから末端分化細胞への変換は段階的なプロセスであり、分化過程での複数の摂動に....

プロトコル

1. 細胞の分化と特性評価

1. 培養試薬および培養プレートの調製
   1. 48 mLの基礎培地に2 mLのサプリメントと0.2%ペニシリン-ストレプトマイシンを加えて、PSC培地を調製します。サプリメントを分注し、-20°Cで保存します。 この培地は4°Cで最大4週間保存してください。
   2. 500 mLの基礎培地に1 mLのサプリメントと0.2%ペニシリン-ストレプトマイシンを加えて、PSC調製培地を調製します。使用する場合は、培地を1回だけ使用するために予熱し、培地を4°Cで最大3週間保存してください。
   3. 1x B27サプリメントからインスリンを差し引いたものと1%ペニシリン-ストレプトマイシンをRPMI 1640に追加して、CM分化培地を調製します。1x B27サプリメントと1%ペニシリン-ストレプトマイシンをRPMI 1640に追加して、CM維持培地を準備します。これら2種類の培地は、4°Cで2週間保存してください。
   4. マトリゲルを氷に沈め、4°Cで一晩保管します。マトリゲルが完全に解凍されていることを確認してください。次に、後で使用するために-80°Cで保存した1 mLのアリコートに分注し、4°Cで49 mLのDMEM/F12に1 mLのマトリゲルを加えて、マトリゲルの作業溶液を調製します。このマトリゲル作業溶液を6ウェル培養プレート....

ディスカッション

ここでは、現在のPSCのアプリケーションと翻訳における主要な問題の1つである細胞分化のばらつきを克服するための詳細なプロトコルについて説明しました。生細胞明視野イメージングとMLを活用することで、PSCの分化を繰り返し最適化し、細胞株やバッチ間で一貫して高い効率を達成しました。しかし、上記の分化プロセスでは、プロトコールのいくつかの重要な.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Diluted digests were used for CPC and CM digestion
4% Paraformaldehyde in PBS	KeyGEN BioTECH	KGIHC016
6-well Cell Culture Plate	NEST	703001
96-well Cell Culture Plate	NEST	701001
B27 Supplement	Gibco	17504044
B27 Supplement Minus Insulin	Gibco	A1895601
Bovine serum albumin (BSA)	GPC BIOTECH	AA904-100G
Celldiscoverer 7	Zeiss		Instruments used to take bright-field images throughout differentiation and final cTnT images
CHIR99021	Selleck	S1263
DMEM/F12	Gibco	12634010
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo	A-21202	Secondary Antibody
FACSAria III	BD Biosciences		Flow cytometry sorter
Fetal Bovine Serum (FBS)	VISTECH	SE100-B
Hoechst 33342	YEASEN	40732ES03
Human Pluripotent Stem Cell Chemical-defined Medium	Cauliscell Inc	400105	Basal medium of PSC preparation medium
iPS-18	TaKaRa	Y00300
iPS-B1	Cellapy	CA4025106
iPS-F	Nuwacell	RC01001-B
iPS-M	Nuwacell	RC01001-A
IWR1-1-endo	Selleck	S7086	IWR1
Jupyter Notebook	N/A	Version 6.4.0	https://jupyter.org/
MATLAB	MathWorks	Version R2020a	Software for scientific computation and image annotation
Matrigel Matrix	Corning	354230	Matrigel
Mouse monoclonal IgG1 anti-cTnT	Thermo	MA5-12960	cTnT primary antibody
Normal Donkey Serum	Jackson	017-000-121
ORCA-Flash 4.0 V3 digital CMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU	The digital camera assembled on Celldiscoverer7
PBS	NEB	21-040-CVR
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Pluripotency Growth Mater 1 basal medium	Cellapy	CA1007500-1	Basal medium of PSC culture medium
Pluripotency Growth Mater 1 supplement	Cellapy	CA1007500-2	Supplement of PSC culture medium
Prism	Graphpad	Version 8/9	Statistical software for statistical analysis and plotting
Python	N/A	version 3.6	Python 3 environment for scientific computation, with packages pytorch (1.9.0), numpy, scipy, pandas, visdom, scikit-learn, scikit-image, opencv-python, and matplotlib software for scientific computation and image annotation.
RPMI 1640	Gibco	11875176
Supplement hPSC-CDM (500x)	Cauliscell Inc	00015	Supplement of PSC preparation medium
TiE	Nikon		An inverted fluorescence microscope (with modification) for region-selevtive purification
Triton X-100	Amresco	9002-93-1
Versene Solution	Thermo	15040066	EDTA solution for PSC digestion
Y27632	Selleck	S6390
Zen	Zeiss	Version 3.1	A supporting software of Celldiscoverer7 for  image acquisition, processing and analysis