Eine auf Lebendzellen basierende Strategie für maschinelles Lernen zur Überwachung der Differenzierung pluripotenter Stammzellen

Zusammenfassung

Die verfügbaren Systeme zur Differenzierung von pluripotenten Stammzellen (PSC) zu funktionellen Zellen werden derzeit durch Probleme mit starker Variabilität von Linie zu Linie und von Charge zu Charge behindert. Hier stellen wir am Beispiel der kardialen Differenzierung ein Protokoll vor, um den Prozess der PSC-Differenzierung auf Basis von bildbasiertem maschinellem Lernen intelligent zu überwachen und zu modulieren.

Zusammenfassung

Technologien für pluripotente Stammzellen (PSC) sind in der Arzneimittelforschung, in der Krankheitsmodellierung und in der regenerativen Medizin weit verbreitet. Verfügbare PSC-zu-funktionelle Zelldifferenzierungssysteme werden jedoch durch Probleme mit starker Variabilität von Linie zu Linie und von Charge zu Charge behindert. Eine präzise Steuerung der Zelldifferenzierung in Echtzeit ist daher wichtig. In diesem Protokoll beschreiben wir eine nicht-invasive und intelligente Strategie, die die Variabilität in der Zelldifferenzierung durch den Einsatz von bildbasiertem maschinellem Lernen überwindet. Am Beispiel der PSC-zu-Kardiomyozyten-Differenzierung liefert diese Methodik detaillierte Informationen für die Kontrolle des PSC-Anfangszustands, die frühzeitige Beurteilung und Intervention in Differenzierungsbedingungen sowie die Eliminierung der falsch differenzierten Zellkontamination, wodurch eine gleichbleibend hochwertige Differenzierung von PSCs zu funktionellen Zellen realisiert wird. Prinzipiell kann diese Strategie auf andere Zelldifferenzierungs- oder Reprogrammierungssysteme mit mehreren Schritten ausgeweitet werden, um die Zellherstellung zu unterstützen und unser Verständnis der Mechanismen während der Zellschicksalsumwandlung zu verbessern.

Einleitung

Pluripotente Stammzellen (PSCs) besitzen die bemerkenswerte Fähigkeit, sich in vitro in viele Zelltypen zu differenzieren. Diese differenzierten funktionellen Zellen könnten für die Zelltherapie, die Modellierung von Krankheiten und die Entwicklung von Medikamenten verwendet werden, die alle für die Forschung oder klinische Anwendungen wertvoll sind ^1,2,3. So wurde beispielsweise eine Vielzahl von Methoden entwickelt, um PSCs in Kardiomyozyten (CMs) zu differenzieren4,5,6,7.

Protokoll

1. Zelldifferenzierung und -charakterisierung

1. Vorbereitung von Kulturreagenzien und Kulturplatten
   1. Bereiten Sie das PSC-Kulturmedium vor, indem Sie 2 ml Nahrungsergänzungsmittel und 0,2 % Penicillin-Streptomycin zu 48 ml Basalmedium hinzufügen. Aliquotieren Sie das Präparat und lagern Sie es bei -20 °C. Lagern Sie dieses Medium bis zu 4 Wochen bei 4 °C.
   2. Bereiten Sie PSC-Präparationsmedium vor, indem Sie 1 ml Nahrungsergänzungsmittel und 0,2 % Penicillin-Streptomycin zu 500 ml Basalmedium hinzufügen. Bei der Verwendung das Medium für den einmaligen Gebrauch vorheizen und das Medium bis ....

Diskussion

Hier haben wir ein detailliertes Protokoll beschrieben, um eines der Hauptprobleme bei der aktuellen PSC-Anwendung und -Translation zu überwinden – die Variabilität in der Zelldifferenzierung. Durch die Nutzung von Hellfeld-Imaging und ML für lebende Zellen haben wir die PSC-Differenzierung iterativ optimiert, um eine gleichbleibend hohe Effizienz über Zelllinien und Chargen hinweg zu erreichen. Im obigen Differenzierungsprozess haben jedoch mehrere kritische Schritte im Protokoll .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Diluted digests were used for CPC and CM digestion
4% Paraformaldehyde in PBS	KeyGEN BioTECH	KGIHC016
6-well Cell Culture Plate	NEST	703001
96-well Cell Culture Plate	NEST	701001
B27 Supplement	Gibco	17504044
B27 Supplement Minus Insulin	Gibco	A1895601
Bovine serum albumin (BSA)	GPC BIOTECH	AA904-100G
Celldiscoverer 7	Zeiss		Instruments used to take bright-field images throughout differentiation and final cTnT images
CHIR99021	Selleck	S1263
DMEM/F12	Gibco	12634010
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo	A-21202	Secondary Antibody
FACSAria III	BD Biosciences		Flow cytometry sorter
Fetal Bovine Serum (FBS)	VISTECH	SE100-B
Hoechst 33342	YEASEN	40732ES03
Human Pluripotent Stem Cell Chemical-defined Medium	Cauliscell Inc	400105	Basal medium of PSC preparation medium
iPS-18	TaKaRa	Y00300
iPS-B1	Cellapy	CA4025106
iPS-F	Nuwacell	RC01001-B
iPS-M	Nuwacell	RC01001-A
IWR1-1-endo	Selleck	S7086	IWR1
Jupyter Notebook	N/A	Version 6.4.0	https://jupyter.org/
MATLAB	MathWorks	Version R2020a	Software for scientific computation and image annotation
Matrigel Matrix	Corning	354230	Matrigel
Mouse monoclonal IgG1 anti-cTnT	Thermo	MA5-12960	cTnT primary antibody
Normal Donkey Serum	Jackson	017-000-121
ORCA-Flash 4.0 V3 digital CMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU	The digital camera assembled on Celldiscoverer7
PBS	NEB	21-040-CVR
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Pluripotency Growth Mater 1 basal medium	Cellapy	CA1007500-1	Basal medium of PSC culture medium
Pluripotency Growth Mater 1 supplement	Cellapy	CA1007500-2	Supplement of PSC culture medium
Prism	Graphpad	Version 8/9	Statistical software for statistical analysis and plotting
Python	N/A	version 3.6	Python 3 environment for scientific computation, with packages pytorch (1.9.0), numpy, scipy, pandas, visdom, scikit-learn, scikit-image, opencv-python, and matplotlib software for scientific computation and image annotation.
RPMI 1640	Gibco	11875176
Supplement hPSC-CDM (500x)	Cauliscell Inc	00015	Supplement of PSC preparation medium
TiE	Nikon		An inverted fluorescence microscope (with modification) for region-selevtive purification
Triton X-100	Amresco	9002-93-1
Versene Solution	Thermo	15040066	EDTA solution for PSC digestion
Y27632	Selleck	S6390
Zen	Zeiss	Version 3.1	A supporting software of Celldiscoverer7 for  image acquisition, processing and analysis