Una estrategia de aprendizaje automático basada en imágenes de células vivas para monitorear la diferenciación de células madre pluripotentes

Resumen

Los sistemas de diferenciación de células madre pluripotentes (PSC) a células funcionales disponibles se ven obstaculizados actualmente por problemas de variabilidad severa de línea a línea y de lote a lote. Aquí, utilizando la diferenciación cardíaca como ejemplo principal, presentamos un protocolo para monitorizar y modular de forma inteligente el proceso de diferenciación de PSC basado en el aprendizaje automático basado en imágenes.

Resumen

Las tecnologías de células madre pluripotentes (PSC) se han utilizado ampliamente en el descubrimiento de fármacos, el modelado de enfermedades y la medicina regenerativa. Sin embargo, los sistemas de diferenciación de PSC a células funcionales disponibles se ven obstaculizados por problemas de variabilidad severa de línea a línea y de lote a lote. Por lo tanto, es importante un control preciso de la diferenciación celular en tiempo real. En este protocolo, describimos una estrategia no invasiva e inteligente que supera la variabilidad en la diferenciación celular mediante el uso de aprendizaje automático basado en imágenes de campo claro. Tomando como ejemplo la diferenciación de PSC a cardiomiocitos, esta metodología proporciona información detallada para el control del estado inicial de PSC, la evaluación temprana y la intervención en las condiciones de diferenciación, y la eliminación de la contaminación celular mal diferenciada, logrando juntos una diferenciación consistente de alta calidad de PSC a células funcionales. En principio, esta estrategia puede extenderse a otros sistemas de diferenciación o reprogramación celular con múltiples pasos para apoyar la fabricación de células, así como para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos durante la conversión del destino celular.

Introducción

Las células madre pluripotentes (PSC) poseen la notable capacidad de diferenciarse en muchos tipos de células in vitro. Estas células funcionales diferenciadas podrían utilizarse para la terapia celular, el modelado de enfermedades y el desarrollo de fármacos, todas ellas valiosas para la investigación o las aplicaciones clínicas ^1,2,3. Por ejemplo, se han desarrollado una variedad de métodos para diferenciar las PSC en cardiomiocitos (CM)4,5,6,7.

Protocolo

1. Diferenciación y caracterización celular

1. Preparación de reactivos de cultivo y placas de cultivo
   1. Prepare el medio de cultivo de PSC agregando 2 mL de suplemento y Penicilina-Estreptomicina al 0,2% a 48 mL de medio basal. Alícuota y almacene el suplemento a -20 °C. Almacene este medio a 4 °C durante un máximo de 4 semanas.
   2. Prepare el medio de preparación de PSC agregando 1 mL de suplemento y 0.2% de penicilina-estreptomicina a 500 mL de medio basal. Cuando lo use, precaliente el medio para un solo uso y guárdelo a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.
   3. Prepare el medio de d....

Discusión

Aquí, describimos un protocolo detallado para superar uno de los principales problemas en la aplicación y traducción actual de PSC: la variabilidad en la diferenciación celular. Al aprovechar las imágenes de campo claro de células vivas y el aprendizaje automático, optimizamos de forma iterativa la diferenciación de PSC para lograr una alta eficiencia constante en todas las líneas celulares y lotes. Sin embargo, en el proceso de diferenciación anterior, varios pasos críticos e.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056	Diluted digests were used for CPC and CM digestion
4% Paraformaldehyde in PBS	KeyGEN BioTECH	KGIHC016
6-well Cell Culture Plate	NEST	703001
96-well Cell Culture Plate	NEST	701001
B27 Supplement	Gibco	17504044
B27 Supplement Minus Insulin	Gibco	A1895601
Bovine serum albumin (BSA)	GPC BIOTECH	AA904-100G
Celldiscoverer 7	Zeiss		Instruments used to take bright-field images throughout differentiation and final cTnT images
CHIR99021	Selleck	S1263
DMEM/F12	Gibco	12634010
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo	A-21202	Secondary Antibody
FACSAria III	BD Biosciences		Flow cytometry sorter
Fetal Bovine Serum (FBS)	VISTECH	SE100-B
Hoechst 33342	YEASEN	40732ES03
Human Pluripotent Stem Cell Chemical-defined Medium	Cauliscell Inc	400105	Basal medium of PSC preparation medium
iPS-18	TaKaRa	Y00300
iPS-B1	Cellapy	CA4025106
iPS-F	Nuwacell	RC01001-B
iPS-M	Nuwacell	RC01001-A
IWR1-1-endo	Selleck	S7086	IWR1
Jupyter Notebook	N/A	Version 6.4.0	https://jupyter.org/
MATLAB	MathWorks	Version R2020a	Software for scientific computation and image annotation
Matrigel Matrix	Corning	354230	Matrigel
Mouse monoclonal IgG1 anti-cTnT	Thermo	MA5-12960	cTnT primary antibody
Normal Donkey Serum	Jackson	017-000-121
ORCA-Flash 4.0 V3 digital CMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU	The digital camera assembled on Celldiscoverer7
PBS	NEB	21-040-CVR
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Pluripotency Growth Mater 1 basal medium	Cellapy	CA1007500-1	Basal medium of PSC culture medium
Pluripotency Growth Mater 1 supplement	Cellapy	CA1007500-2	Supplement of PSC culture medium
Prism	Graphpad	Version 8/9	Statistical software for statistical analysis and plotting
Python	N/A	version 3.6	Python 3 environment for scientific computation, with packages pytorch (1.9.0), numpy, scipy, pandas, visdom, scikit-learn, scikit-image, opencv-python, and matplotlib software for scientific computation and image annotation.
RPMI 1640	Gibco	11875176
Supplement hPSC-CDM (500x)	Cauliscell Inc	00015	Supplement of PSC preparation medium
TiE	Nikon		An inverted fluorescence microscope (with modification) for region-selevtive purification
Triton X-100	Amresco	9002-93-1
Versene Solution	Thermo	15040066	EDTA solution for PSC digestion
Y27632	Selleck	S6390
Zen	Zeiss	Version 3.1	A supporting software of Celldiscoverer7 for  image acquisition, processing and analysis