胚胎和幼体斑马鱼的高分辨率细胞移植

摘要

在这里，我们提出了一种方案，可以在受精后至少 1 到 7 天之间的任何阶段将具有高空间和时间分辨率的细胞移植到斑马鱼胚胎和幼虫中。

摘要

发育和再生是通过遗传编码的时空动态细胞相互作用过程发生的。使用动物之间的细胞移植来追踪细胞命运并诱导供体细胞和宿主细胞的遗传、空间或时间特性不匹配，是检查这些相互作用性质的有力手段。雏鸡和两栖动物等生物分别为我们理解发育和再生做出了重要贡献，这在很大程度上是因为它们适合移植。然而，这些模型的力量受到遗传易处理性低的限制。同样，主要的遗传模式生物对移植的适应性较低。

斑马鱼是发育和再生的主要遗传模型，虽然细胞移植在斑马鱼中很常见，但它通常仅限于在囊胚和原肠发育的早期阶段转移未分化的细胞。在本文中，我们提出了一种简单而强大的方法，该方法将斑马鱼移植窗口扩展到受精后至少 1 到 7 天之间的任何胚胎或幼虫阶段。这种方法的精确性允许在供体和宿主动物中以近乎完美的空间和时间分辨率移植低至一个细胞。虽然我们在这里强调胚胎和幼虫神经元的移植分别用于研究神经发育和再生，但这种方法适用于广泛的祖细胞和分化细胞类型和研究问题。

引言

细胞移植作为发育生物学的基础技术有着悠久而传奇的历史。在 20^世纪之交，使用物理操作来扰乱发育过程的方法，包括移植，将胚胎学从观察科学转变为实验科学 ^1,2。在一项具有里程碑意义的实验中，Hans Spemann 和 Hilde Mangold 将蝾螈胚胎的背胚孔唇异位移植到宿主胚胎的另一侧，诱导附近的组织形成次级体轴³。该实验表明，细胞可以诱导其他细胞接受某些命运，随后，移植发展成为一种强大的方法，用于询问发育生物学中有关能力和细胞命运决定、细胞谱系、诱导能力、可塑性和干细胞效力的关键问题 ^1,4,5。

最近的科学进展扩大了移植方法的力量。1969 年，Nicole Le Douarin 发现核仁染色可以区分鹌鹑雏鸡嵌合体中的起源物种，从而可以追踪移植的细胞及其后代⁶。这一概念后来因转基因荧光标记物和先进成像技术的出现而得到加强⁵，并已被用于追踪细胞命运 ^6,7、识别干细胞及其效力 ^8,9 以及追踪大脑发育过程中的细胞运动¹⁰。此外，分子遗传学的兴起促进了不同基因型的宿主和供体之间的移植，支持对发育因子的自主和非自主功能的精确解剖¹¹。

移植还通过阐明调节再生组织生长和模式的细胞身份和相互作用，为再生研究做出了重要贡献，特别是在涡虫和蝾螈等具有强大再生能力的生物体中。移植研究揭示了效力¹²、空间模式^{的原理 13,14}、特定组织的贡献^15,16 以及细胞记忆^12,17 在再生中的作用。

斑马鱼是研究发育和再生（包括神经系统）的主要脊椎动物模型，因为它们的遗传程序保守、遗传易处理性高、外部受精、离合器大小大和光学清晰度 18,19,20。斑马鱼在早期发育阶段也非常适合移植。最突出的方法是在囊胚或原肠胚阶段将细胞从标记的供体胚胎移植到宿主胚胎，以产生嵌合动物。在囊胚阶段移植的细胞会随着 epiboly 开始时分散和分散，在胚胎中产生标记细胞和组织的马赛克²¹。胃移植允许根据粗略的命运图对移植的细胞进行一些靶向，因为盾牌形成并且可以确定 A-P 和 DV 轴²¹。所得的嵌赛图在确定基因是否自主作用于细胞、测试细胞定型以及绘制整个发育过程中的组织运动和细胞迁移图谱方面很有价值 ^5,11。花叶斑马鱼可以通过多种方式产生，包括电穿孔²²、重组²³ 以及 F0 转基因²⁴ 和诱变²⁵，但移植在空间、时间以及细胞数量和类型方面提供了最大的可操作性和精度。斑马鱼移植的现状主要局限于早期的祖细胞，只有少数例外，包括受精后前 10-30 小时移植脊髓运动神经元^26,27、视网膜神经节细胞^28,29 和神经嵴细胞 （hpf）³⁰，以及成年斑马鱼的造血细胞和肿瘤细胞 ^5,31.将移植方法扩展到广泛的年龄、分化阶段和细胞类型将大大增强这种方法的能力，以提供对发育和再生过程的见解。

在这里，我们展示了一种灵活而强大的高分辨率细胞移植技术，可在受精后至少 7 天内对斑马鱼胚胎和幼虫有效。在靶组织中表达荧光蛋白的转基因宿主和供体鱼可用于提取单细胞并以近乎完美的空间和时间分辨率进行移植。斑马鱼胚胎和幼虫的光学清晰度允许在宿主动物发育或再生时对移植的细胞进行实时成像。这种方法以前已被用于检查时空信号动力学如何影响胚胎中的神经元身份和轴突导向³²，并检查内在和外在因素在幼鱼再生过程中促进轴突导向^{的逻辑 33}。虽然我们在这里专注于分化神经元的移植，但我们的方法广泛适用于许多阶段和组织的未分化和分化细胞类型，以解决发育和再生中的问题。

研究方案

该程序与活体斑马鱼相关的所有方面均已获得明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准，并按照 IACUC 指南执行。

1. 移植装置的一次性初始设置（图 1）

1. 按照制造商的说明组装移植显微镜。
   注意：该协议使用具有 40 倍水浸物镜的正置荧光显微镜。
2. 组装粗略和精细的显微操作器，并根据制造商的说明将它们安装在显微镜的右侧。
   注意：由于载物台相对于针头不在 Z 维度上移动很重要，因此我们使用固定载物台显微镜，并将显微操作器安装在显微镜底座上。如果没有固定载物台显微镜，则可以将显微操作器安装到载物台上。
3. 将微电极支架连接到电极手柄上，并安装在显微操作器上。
4. 将三通旋塞阀的一侧连接到微量注射泵。使用色谱适配器将旋塞阀的另一侧连接到聚乙烯管。
5. 使用色谱适配器将聚乙烯管的另一侧连接到微电极支架。
6. 用轻质矿物油填充 10 mL 储液槽注射器，并将其安装在旋塞阀的顶部。
7. 用储液罐中的矿物油填充微量注射泵和管道（液压管路），确保去除所有气泡。
   注意：设备设置完成后，只需偶尔维护液压管路。必要时，可以取出储液罐注射器并重新填充矿物油。

2. 准备胚胎推杆。

1. 剪下一根 2 cm 的钓鱼线，将其部分插入 P1000 移液器吸头的窄端，露出 ~1.5 cm。用一小滴强力胶固定钓鱼线并晾干。

3. 准备解决方案。

1. 要制备溶于胚胎培养基 （LMA） 中的 1% 低熔点琼脂糖，请将琼脂糖溶解在沸腾的胚胎培养基^{中 34}。在圆底试管中制备 1-2 mL 等分试样，并在 4 °C 下储存。
2. 将以下成分混合至终浓度为 116 mM NaCl、2.9 mM KCl、1.8 mM CaCl2、5 mM HEPES pH 7.2、50 单位/mL 青霉素和 50 ug/mL 链霉素，搅拌至溶解，然后通过真空过滤器，用青霉素-链霉素和三卡因 （RPT） 制备林格氏溶液。在室温下储存。使用前立即添加三卡因至浓度为 0.02%。

4. 准备供体和寄主动物进行移植。

1. 将适当基因型的宿主和供体动物饲养到所需的年龄，并用荧光标记感兴趣的细胞。
   注意：对于这些移植，我们使用 Tg（isl1：EGFPCAAX）^fh474 供体动物³² 和 Tg（isl1：mRFP）^fh1 宿主动物³⁵ ，并将神经元从供体移植到宿主迷走神经运动核 3dpf。
2. 通过在每张载玻片上涂抹矩形轮廓的透明指甲油来准备移植载玻片（图 2A）。指甲油会形成一个疏水屏障，以保持在步骤 4.8 中添加的 RPT 中。使用前让其完全干燥。
   注：玻片可以提前准备并无限期储存。
3. 将一管 LMA 放入装有 40mL 水的 50mL 烧杯中，以 50% 的功率微波 1 分钟或直至熔化，熔化一个 LMA 等分试样。在干浴加热器中将 LMA 保持在 40 °C。
4. 用镊子（如果适用）对宿主和供体动物进行去绒毛膜化，并将它们放入装满室温 RPT 的小培养皿中麻醉它们。等待 5 分钟，让动物完全麻醉后再继续。
5. 安装个体供体和宿主动物：使用巴斯德移液器和移液泵，将动物从 RPT 转移到 LMA，然后将小滴 LMA 将动物转移到指甲油轮廓内的载玻片上。尽量减少转移到 LMA 中的 RPT 量，以便 LMA 不会被稀释。在 LMA 凝固之前，使用胚胎推杆定位动物，确保每只动物都安装在预期的针插入部位右侧，并且所有动物都垂直对齐（图 2B）;在继续之前，让琼脂糖完全凝固（~5 分钟）。
   注意：由于可以从每只供体动物中提取许多细胞，因此在每个载玻片上放置 2-4 只宿主动物和一个供体会更有效。
6. 使用手术刀，在封口动物右侧的所有琼脂糖滴中切出一个笔直的垂直切片（图 2C）。用实验室湿巾从载玻片上去除松散的琼脂糖。
7. 使用手术刀从琼脂糖中切出楔子以暴露针头插入部位（图 2C）。用实验室湿巾从载玻片上去除松散的琼脂糖。
8. 将 RPT 应用于载玻片，直到琼脂糖滴完全浸没（图 2D）。
9. 将准备好的载玻片安装在移植显微镜上。在 40 倍目标下聚焦供体动物。为此，请降低物镜，直到它打破介质表面，然后将物镜升高到所需的焦平面。
   注意：必须保持物镜的液体接触，直到移植完成（图 3C）。
10. 聚焦感兴趣的荧光标记的供体细胞;然后，将载物台向左移动，准备找到移植针。
    注意：此时，不要在 Y 轴或 Z 轴上调整显微镜，以确保您可以轻松地在第 5 部分中重新找到供体动物。

5. 准备移植针。

1. 将微量移液器插入微量移液器拉拔器并拉动微量注射针。
   注意：针头的形状应类似于用于 1 细胞阶段斑马鱼胚胎注射或膜片钳的形状。我们将微量移液器拉拔器与以下程序一起使用：压力 = 500，热量 = 斜坡 + 80，拉力 = 90，速度 = 70，时间 = 250（参见 材料表），尽管可能需要根据经验确定每个拉拔器的正确设置。
2. 在解剖镜下，将针尖与载物台千分尺的划分对齐。使用千分尺作为测量指南，使用一对锋利的镊子将针头折断至略大于感兴趣细胞直径的孔径（图 3A）。确保断裂处尽可能干净，因为锯齿状边缘会导致针头堵塞。注意：对于迷走神经运动神经元（直径 5-7 μm），针头应折断至 10 μm 的内径，相当于 20 μm 的外径。如果需要，可以使用微锻造或微磨床³⁶ 来精炼针尖的大小、形状和/或角度。
3. 使用装满轻质矿物油并配备移液器填充物的 50 mL 注射器，用矿物油完全填充针头（图 3B）。确保没有气泡。将装满的针放在一边，直到准备好安装。
   注：为确保没有气泡，请将移液器进液器完全插入进样针中并放出油，同时缓慢地将进液管从进样针中拉出。
4. 在移植装置上，转动三通旋塞阀，使其长臂面向微量注射器泵，然后按下储液器注射器柱塞以冲洗液压管路上的所有气泡。在柱塞上保持轻压（以防止空气回流到管路中）并转动三通旋塞阀，使其长臂面向储液罐注射器。
5. 将针插入支架，注意不要引入任何气泡。调整针的角度，使其以与水平面成 10-15° 的角度直接面向左侧（图 3C）。
6. 使用粗略和精细的显微操作器在显微镜物镜下操纵针尖并将其聚焦（图 3D）。
   注意：可以通过在操纵针头时直接观察物镜下方的区域来粗略定位针头在 X 和 Y 平面上，因为当针头位于物镜下方时，它会反射透射光束。然后可以使用显微镜目镜进行精细定位。在此步骤中，请勿调整显微镜载物台的位置或焦距。使用显微操作器将针尖置于现有焦点位置。
7. 如果液体流入或流出针尖，请使用注射泵调节压力，直到观察到矿物油和林格氏溶液之间出现稳定的弯月面（图 3D）。
   注意：如果稳定后针尖仍有油泡，可以通过使用粗显微操作器上的 X 平面调整将其向右移动，直到其尖端从 RPT 中退出，然后回到左侧，直到它重新定位在物镜下方。

6. 移植

注意：所有针头移动都应使用本节的精细显微操作器完成。

1. 将载物台向右移动，直到供体动物重新进入视野，小心避免针头意外插入。
2. 重新居中并专注于要移植的细胞，并将针头与动物外部的细胞对齐（图 4A）。
   注意：您可能需要经常在明场和荧光之间切换，以确保正确对齐。使用中性密度滤波器有助于同时可视化两者。
3. 将针头插入供体动物中。
   注意： 用针头反复进出有助于穿透皮肤。
4. 立即用微量注射泵重新稳定针尖中的油弯月面，如步骤 5.7 所述。
5. 将针尖靠在感兴趣的细胞上，并用微量注射泵轻轻吸力（图 4B）。
   注：吸取过程中轻柔的进出运动有助于松动细胞。
6. 当吸收足够数量的细胞时，从供体中取出针头，并立即用微量注射泵重新稳定针尖中的油弯月面。
7. 小心避免用针头接触动物或琼脂糖，重新定位载物台以使第一只宿主动物进入视野。
8. 将细胞置于要放置的区域居中并聚焦，并将针头与动物外的该区域对齐（图 4C）。
9. 将针头插入宿主动物，并立即用微量注射泵重新稳定针尖中的油弯月面。
10. 将针尖置于沉积部位，并用微量注射泵轻轻按压，直到从针头中释放出正确数量的供体细胞（图 4D）。
    注：如果供体细胞和宿主细胞用不同的荧光团标记，则在此阶段使用多波段滤光片进行同步观察可能非常有用。
11. 从宿主上取下针头，并立即使用微量注射泵重新稳定针尖中的油弯月面。
12. 对所有剩余主机重复步骤 6.7-6.11。

7. 宿主动物恢复

1. 抬起 40 倍物镜，并使用粗略的显微操作器将针头操纵回上样位置。
   注意：针头可以重复用于多个玻片。
2. 从移植显微镜中取出载玻片，并将其置于解剖显微镜下。
3. 用镊子小心地将宿主动物从 LMA 液滴中取出，以卸载宿主动物。使用玻璃巴斯德移液器，将宿主动物转移到装有新鲜林格溶液和青霉素/链霉素的培养皿中。确保动物从麻醉中恢复并将它们保存在胚胎培养箱中，直到准备好成像。根据批准的方案对供体动物实施安乐死。
   注意：我们的安乐死方法是将动物浸入冰浴中至少 1 小时，然后浸入 500 mg/L 次氯酸钠中。

结果

通过使用荧光显微镜在移植后的适当时间点观察宿主动物中荧光标记的供体细胞，可以直接观察移植实验的结果。在这里，我们以 3 dpf 移植了单个前迷走神经神经元。然后将宿主动物孵育 12 或 48 小时，麻醉，安装在玻璃盖玻片上的 LMA 中，并用共聚焦显微镜成像（图 5）。在移植后 12 小时 （hpt），我们观察到成功移植的供体神经元（

讨论

一个多世纪以来，发育和再生生物学一直依靠移植实验来研究细胞信号传导和细胞命运决定的原理。斑马鱼模型已经代表了遗传和移植方法的强大融合。在囊胚和原肠阶段移植以产生马赛克动物很常见，但它可以解决的问题类型有限。晚期移植很少见，尽管已经报道了分别以 16-18 hpf 和 30-33 hpf 移植胚胎脊髓运动神经元和视网膜神经节细胞的方法 26,27,28。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010