ゼブラフィッシュの胚および幼生における高分解能細胞移植

要約

ここでは、受精後少なくとも1〜7日の任意の段階で、ゼブラフィッシュの胚と幼虫に高い空間的および時間的解像度で細胞を移植するためのプロトコルを紹介します。

要約

発生と再生は、遺伝的にコード化された時空間的に動的な細胞相互作用のプロセスによって発生します。動物間の細胞移植を使用して細胞の運命を追跡し、ドナー細胞と宿主細胞の遺伝的、空間的、または時間的特性のミスマッチを誘発することは、これらの相互作用の性質を調べるための強力な手段です。ヒヨコや両生類などの生物は、主に移植に適しているため、それぞれ発生と再生の理解に重要な貢献をしてきました。しかし、これらのモデルの能力は、遺伝的扱い性が低いために制限されてきた。同様に、主要な遺伝子モデル生物は移植に対する適合性が低い。

ゼブラフィッシュは発生と再生の主要な遺伝モデルであり、ゼブラフィッシュでは細胞移植が一般的ですが、一般的には発生の初期の胞胚および原腸段階での未分化細胞の移植に限定されています。この記事では、ゼブラフィッシュの移植ウィンドウを受精後少なくとも1〜7日の間の任意の胚期または幼虫期に拡張するシンプルで堅牢な方法を紹介します。このアプローチの精度により、ドナー動物と宿主動物の両方で、ほぼ完璧な空間的および時間的解像度で、わずか1つの細胞を移植することができます。ここでは、神経の発生と再生の研究のために、それぞれ胚ニューロンと幼虫ニューロンの移植に焦点を当てていますが、このアプローチは、幅広い前駆細胞と分化細胞の種類、および研究課題に適用できます。

概要

細胞移植は、発生生物学の基礎技術として長い歴史を持っています。20^世紀初頭頃、移植を含む発生過程を物理的に操作するアプローチにより、発生学は観察科学から実験科学へと変貌を遂げた^1,2。ある画期的な実験では、ハンス・シュペーマンとヒルデ・マンゴールドが、サンショウウオ胚の背側胚盤胞唇を宿主胚の反対側に異所性移植し、近くの組織に二次^{体軸を形成する}ように誘導した3。この実験により、細胞が他の細胞を特定運命に誘導できることが示され、その後、移植は、能力と細胞運命決定、細胞系譜、誘導能力、可塑性、および幹細胞の^{効力に関する}発生生物学の重要な問題を問うための強力な方法として開発されました^1,4,5。

最近の科学の進歩により、移植アプローチの力が拡大しています。1969年、Nicole Le Douarinが核小体染色によりウズラ-ヒヨドリキメラの起源種を区別できるという発見により、移植された細胞とその子孫の追跡が可能になりました

プロトコル

生きたゼブラフィッシュの取り扱いに関連するこの手順のすべての側面は、ミネソタ大学の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されており、IACUCガイドラインに準拠して実施されています。

1. 移植装置の1回限りの初期設定(図1)

1. メーカーの指示に従って移植顕微鏡を組み立てます。
   注:このプロトコルでは、40倍の水浸対物レンズを備えた正立蛍光顕微鏡を使用します。
2. 粗いマイクロマニピュレーターと細かいマイクロマニピュレーターを組み立て、製造元の指示に従って顕微鏡の右側に取り付けます。
   注:ステージが針に対してZ次元に移動しないことが重要であるため、マイクロマニピュレーターを顕微鏡ベースに取り付けた固定ステージ顕微鏡を使用します。固定ステージ顕微鏡が利用できない場合は、マイクロマニピュレーターをステージに取り付けることができます。
3. 電極ハンドルに微小電極ホルダーを取り付け、マイクロマニピュレーターに取り付けます。
4. 三方活栓の片側をマイクロシリンジポンプに接続します。クロマトグラフィーアダプターを使用して、ストップコックの反対側をポリエチレンチューブに接続します。
5. クロマ....

ディスカッション

発生生物学と再生生物学は、1世紀以上にわたり、細胞シグナル伝達と細胞運命決定の原理を調べるために移植実験に依存してきました。ゼブラフィッシュモデルは、すでに遺伝的アプローチと移植アプローチの強力な融合を表しています。胞胚期と原腸期に移植してモザイク動物を作製することは一般的ですが、対処できる問題の種類は限られています。後期移植?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010