Transplantation cellulaire à haute résolution chez le poisson-zèbre embryonnaire et larvaire

Résumé

Nous présentons ici un protocole de transplantation de cellules à haute résolution spatiale et temporelle chez des embryons et des larves de poisson-zèbre à n’importe quel stade entre au moins 1 et 7 jours après la fécondation.

Résumé

Le développement et la régénération se produisent par un processus d’interactions cellulaires dynamiques, spatio-temporelles codées génétiquement. L’utilisation de la transplantation cellulaire entre animaux pour suivre le destin cellulaire et induire des décalages dans les propriétés génétiques, spatiales ou temporelles des cellules donneuses et hôtes est un moyen puissant d’examiner la nature de ces interactions. Des organismes tels que les poussins et les amphibiens ont apporté des contributions cruciales à notre compréhension du développement et de la régénération, respectivement, en grande partie en raison de leur facilité de transplantation. La puissance de ces modèles, cependant, a été limitée par une faible traçabilité génétique. De même, les principaux organismes modèles génétiques sont moins susceptibles d’être transplantés.

Le poisson-zèbre est un modèle génétique majeur pour le développement et la régénération, et bien que la transplantation cellulaire soit courante chez le poisson zèbre, elle est généralement limitée au transfert de cellules indifférenciées aux premiers stades de développement de la blastula et de la gastrula. Dans cet article, nous présentons une méthode simple et robuste qui permet d’étendre la fenêtre de transplantation du poisson-zèbre à tout stade embryonnaire ou larvaire entre au moins 1 et 7 jours après la fécondation. La précision de cette approche permet de transplanter aussi peu qu’une cellule avec une résolution spatiale et temporelle presque parfaite chez les animaux donneurs et hôtes. Bien que nous soulignions ici la transplantation de neurones embryonnaires et larvaires pour l’étude du développement et de la régénération nerveuses, respectivement, cette approche est applicable à un large éventail de types de cellules progénitrices et différenciées et de questions de recherche.

Introduction

La transplantation cellulaire a une longue et riche histoire en tant que technique fondamentale en biologie du développement. Au tournant du^{XXe siècle,} des approches utilisant des manipulations physiques pour perturber le processus de développement, y compris la transplantation, ont transformé l’embryologie d’une science d’observation en une science expérimentale ^1,2. Dans une expérience marquante, Hans Spemann et Hilde Mangold ont transplanté de manière ectopique la lèvre blastopore dorsale d’un embryon de salamandre sur le côté opposé d’un embryon hôte, induisant le tissu voisin à former un axe corporel secondaire³. Cette expérience a montré que les cellules pouvaient induire d’autres cellules à adopter certains destins, et par la suite, la transplantation s’est développée comme une méthode puissante pour interroger des questions critiques en biologie du développement concernant la compétence et la détermination du destin cellulaire, la lignée cellulaire, la capacité inductive, la plasticité et la puissance des cellules souches ^1,4,5.

Des progrès scientifiques plus récents ont élargi la puissance de l’approche de la transplantation. En 1969, la découverte de Nicole Le Douarin selon laquelle la coloration nucléolaire pouvait distinguer les espèces d’origine dans les chimères de caille a permis de suivre les cellules transplantées et leur descendance⁶. Ce concept a ensuite été suralimenté par l’avènement des marqueurs fluorescents transgéniques et des techniques d’imagerie avancées⁵, et a été exploité pour suivre le destin cellulaire ^6,7, identifier les cellules souches et leur puissance ^8,9 et suivre les mouvements cellulaires pendant le développement du cerveau¹⁰. De plus, l’essor de la génétique moléculaire a facilité la transplantation entre hôtes et donneurs de génotypes distincts, soutenant une dissection précise des fonctions autonomes et non autonomes des facteurs de développement¹¹.

La transplantation a également apporté d’importantes contributions à l’étude de la régénération, en particulier chez les organismes dotés de fortes capacités de régénération tels que les planaires et les axolotls, en élucidant les identités cellulaires et les interactions qui régulent la croissance et la structuration des tissus en régénération. Des études de transplantation ont révélé les principes de la puissance¹², de la structuration spatiale^13,14, des contributions de tissus spécifiques^15,16 et des rôles de la mémoire cellulaire^12,17 dans la régénération.

Le poisson-zèbre est un modèle de vertébré de premier plan pour l’étude du développement et de la régénération, y compris dans le système nerveux, en raison de ses programmes génétiques conservés, de sa traçabilité génétique élevée, de sa fécondation externe, de sa grande taille de couvée et de sa clarté optique 18,19,20. Les poissons-zèbres sont également très susceptibles d’être transplantés aux premiers stades de développement. L’approche la plus importante est la transplantation de cellules d’un embryon de donneur marqué à un embryon hôte au stade de blastula ou de gastrula pour générer des animaux mosaïques. Les cellules transplantées au stade de blastula se disperseront et se disperseront au début de l’épibole, produisant une mosaïque de cellules et de tissus marqués à travers l’embryon²¹. Les greffes de gastrula permettent de cibler les cellules transplantées selon une carte approximative du destin lorsque le bouclier se forme et que les axes A-P et D-V peuvent être déterminés²¹. Les mosaïques résultantes ont été précieuses pour déterminer si les gènes agissent de manière autonome entre les cellules, tester l’engagement cellulaire et cartographier le mouvement des tissus et la migration cellulaire tout au long du développement ^5,11. Le poisson-zèbre mosaïque peut être généré de plusieurs manières, notamment l’électroporation²², la recombinaison²³ et la transgenèse F0²⁴ et la mutagenèse²⁵, mais la transplantation offre la plus grande manipulabilité et précision dans l’espace, le temps, le nombre et les types de cellules. L’état actuel de la transplantation de poisson-zèbre est largement limité aux cellules progénitrices à des stades précoces, à quelques exceptions près, notamment la transplantation de motoneurones spinaux^26,27, de cellules ganglionnaires rétiniennes^28,29 et de cellules de crête neurale dans les 10 à 30 premières heures suivant la fécondation (hpf)³⁰, et de cellules hématopoïétiques et tumorales chez le poisson-zèbre adulte ^5,31. L’extension des méthodes de transplantation à un large éventail d’âges, de stades de différenciation et de types de cellules augmenterait considérablement la puissance de cette approche pour fournir des informations sur les processus de développement et de régénération.

Ici, nous démontrons une technique flexible et robuste de transplantation cellulaire à haute résolution efficace chez les embryons et les larves de poisson-zèbre jusqu’à au moins 7 jours après la fécondation. Des poissons hôtes et donneurs transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les tissus cibles peuvent être utilisés pour extraire des cellules uniques et les transplanter avec une résolution spatiale et temporelle presque parfaite. La clarté optique des embryons et des larves de poisson-zèbre permet d’imager en direct les cellules transplantées au fur et à mesure que l’animal hôte se développe ou se régénère. Cette approche a déjà été utilisée pour examiner comment la dynamique de signalisation spatio-temporelle influence l’identité neuronale et le guidage axonal chez l’embryon³², et pour examiner la logique par laquelle les facteurs intrinsèques et extrinsèques favorisent le guidage axonal pendant la régénération chez les poissons larvaires³³. Bien que nous nous concentrions ici sur la transplantation de neurones différenciés, notre méthode est largement applicable aux types de cellules indifférenciées et différenciées à travers de nombreux stades et tissus pour répondre aux questions de développement et de régénération.

Protocole

Tous les aspects de cette procédure qui concernent le travail avec des poissons-zèbres vivants ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Minnesota (IACUC) et sont effectués conformément aux directives de l’IACUC.

1. Configuration initiale unique de l’appareil de transplantation (Figure 1)

1. Assemblez le microscope de transplantation selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE : Ce protocole utilise un microscope à fluorescence vertical avec un objectif d’immersion dans l’eau 40x.
2. Assemblez les micromanipulateurs grossiers et fins et montez-les sur le côté droit du microscope selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE : Parce qu’il est important que la platine ne se déplace pas dans la dimension Z par rapport à l’aiguille, nous utilisons un microscope à platine fixe avec les micromanipulateurs montés sur la base du microscope. Si un microscope à platine fixe n’est pas disponible, le micromanipulateur peut être monté sur la platine.
3. Fixez le support de microélectrode à la poignée de l’électrode et montez-le sur le micromanipulateur.
4. Connectez un côté du robinet d’arrêt à trois voies à la pompe à microseringue. Connectez l’autre côté du robinet d’arrêt au tube en polyéthylène à l’aide de l’adaptateur de chromatographie.
5. Connectez le côté opposé du tube en polyéthylène au porte-microélectrode à l’aide de l’adaptateur de chromatographie.
6. Remplissez la seringue réservoir de 10 ml d’huile minérale légère et montez-la sur la face supérieure du robinet d’arrêt.
7. Remplissez la pompe à microseringue et le tube (la conduite hydraulique) avec de l’huile minérale du réservoir, en veillant à éliminer toutes les bulles d’air.
   REMARQUE : Une fois l’appareil installé, il ne nécessitera qu’un entretien occasionnel de la conduite hydraulique. La seringue réservoir peut être retirée et remplie d’huile minérale si nécessaire.

2. Préparez des pousseurs d’embryons.

1. Coupez un morceau de fil de pêche de 2 cm et insérez-le partiellement dans l’extrémité étroite d’une pointe de pipette P1000, en laissant ~1,5 cm exposé. Fixez la ligne de pêche avec une petite goutte de superglue et laissez sécher.

3. Préparez des solutions.

1. Pour préparer de l’agarose à 1 % à bas point de fusion dissoute dans un milieu embryonnaire (LMA), dissolvez l’agarose dans un milieu embryonnaire bouillant³⁴. Préparez des aliquotes de 1 à 2 mL dans des tubes à essai à fond rond et conservez-les à 4 °C.
2. Préparez la solution de Ringer avec de la pénicilline-streptomycine et de la tricaïne (RPT) en combinant les ingrédients suivants à des concentrations finales de 116 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM de HEPES pH 7,2, 50 unités/mL de pénicilline et 50 ug/mL de streptomycine, en remuant jusqu’à dissolution et en passant à travers un filtre sous vide. Conserver à température ambiante. Ajouter la tricaïne immédiatement avant l’utilisation à une concentration de 0,02 %.

4. Préparez les animaux donneurs et hôtes à la transplantation.

1. Élevez des animaux hôtes et donneurs des génotypes appropriés, et avec des cellules d’intérêt marquées par fluorescence, jusqu’à l’âge désiré.
   REMARQUE : Pour ces greffes, nous avons utilisé des animaux donneurs Tg(isl1 :EGFPCAAX)^{fh474 32} et des animaux hôtes Tg(isl1 :mRFP)^{fh1 35} et des neurones transplantés de noyaux moteurs vagues du donneur à l’hôte à 3dpf.
2. Préparez les lames de transplantation en appliquant un contour rectangulaire de vernis à ongles transparent sur chaque lame de verre (Figure 2A). Le vernis à ongles crée une barrière hydrophobe pour retenir le RPT ajouté à l’étape 4.8. Laisser sécher complètement avant utilisation.
   REMARQUE : Les diapositives peuvent être préparées à l’avance et stockées indéfiniment.
3. Faites fondre une aliquote de LMA en plaçant un tube de LMA dans un bécher de 50 ml contenant 40 ml d’eau et en le faisant cuire au micro-ondes pendant 1 minute à 50 % de puissance ou jusqu’à ce qu’il soit fondu. Maintenir la LMA à 40 °C dans un chauffe-bain sec.
4. Déchorionnez les animaux hôtes et donneurs à l’aide de pinces (le cas échéant) et anesthésiez-les en les plaçant dans de petites boîtes de Pétri remplies de RPT à température ambiante. Attendez 5 minutes que les animaux soient complètement anesthésiés avant de continuer.
5. Montez les animaux donneurs et hôtes individuels : à l’aide d’une pipette Pasteur et d’une pompe à pipette, transférez les animaux de la RPT à la LMA, puis transférez les animaux en petites gouttes de LMA sur des lames à l’intérieur du contour du vernis à ongles. Réduire au minimum la quantité de RTT transférée dans la DMT afin que celle-ci ne se dilue pas. Avant que le LMA ne se solidifie, utilisez un poussoir d’embryons pour orienter les animaux, en vous assurant que chaque animal est monté avec le site d’insertion de l’aiguille prévu à droite, et que tous les animaux sont alignés verticalement (figure 2B) ; Laisser l’agarose prendre complètement (~5 min) avant de continuer.
   REMARQUE : Étant donné que de nombreuses cellules peuvent être prélevées sur chaque animal donneur, il est plus efficace de monter 2 à 4 animaux hôtes avec un donneur sur chaque lame.
6. À l’aide d’un scalpel, coupez une tranche verticale droite à travers toutes les gouttes d’agarose juste à droite des animaux montés (figure 2C). Retirez l’agarose en vrac de la lame avec des lingettes de laboratoire.
7. À l’aide d’un scalpel, découpez des coins dans l’agarose pour exposer le site d’insertion de l’aiguille (figure 2C). Retirez l’agarose en vrac de la lame avec des lingettes de laboratoire.
8. Appliquez le RPT sur la lame jusqu’à ce que les gouttes d’agarose soient complètement immergées (figure 2D).
9. Montez la lame préparée sur le microscope de transplantation. Mettez l’accent sur l’animal donneur sous l’objectif 40x. Pour ce faire, abaissez l’objectif jusqu’à ce qu’il brise la surface du support, puis élevez l’objectif au plan focal souhaité.
   REMARQUE : Le contact avec le liquide par l’objectif doit être maintenu jusqu’à ce que la transplantation soit terminée (figure 3C).
10. Mettre au point la ou les cellules donneuses d’intérêt marquées par fluorescence ; Ensuite, déplacez la platine vers la gauche en préparation de la localisation de l’aiguille de greffe.
    REMARQUE : À ce stade, n’ajustez pas le microscope sur les axes Y ou Z, pour vous assurer que vous pouvez facilement retrouver l’animal donneur dans la section 5.

5. Préparez l’aiguille de greffe.

1. Insérez une micropipette dans l’extracteur de micropipette et tirez une aiguille de micro-injection.
   REMARQUE : La forme de l’aiguille doit être similaire à celles utilisées pour les injections d’embryons de poisson-zèbre au stade 1 cellule ou le clampage par patch. Nous utilisons un extracteur de micropipette avec le programme suivant : PRESSION = 500, CHALEUR = rampe + 80, TRACTION = 90, VITESSE = 70, TEMPS = 250 (voir le tableau des matériaux), bien que les paramètres corrects pour chaque extracteur devront probablement être déterminés empiriquement.
2. Alignez la pointe de l’aiguille avec les divisions du micromètre de la platine sous une lunette de dissection. En utilisant le micromètre comme guide de mesure, utilisez une paire de pinces aiguisées pour casser l’aiguille à une taille d’alésage légèrement supérieure au diamètre des cellules d’intérêt (Figure 3A). Assurez-vous que la cassure est aussi propre que possible, car les bords déchiquetés peuvent contribuer au colmatage de l’aiguille. REMARQUE : Pour les motoneurones vagues (5-7 μm de diamètre), les aiguilles doivent être cassées à un diamètre intérieur de 10 μm, ce qui correspond à un diamètre extérieur de 20 μm. Si nécessaire, la taille, la forme et/ou l’angle de la pointe de l’aiguille peuvent être affinés à l’aide d’une microforge ou d’un microbroyeur³⁶.
3. À l’aide d’une seringue de 50 mL remplie d’huile minérale légère et équipée d’une remplisseuse de pipette, remplissez complètement l’aiguille d’huile minérale (figure 3B). Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air. Mettez l’aiguille remplie de côté jusqu’à ce qu’elle soit prête à être montée.
   REMARQUE : Pour vous assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air, insérez le remplisseur de pipette à fond dans l’aiguille et libérez l’huile tout en retirant lentement le remplissage hors de l’aiguille.
4. Sur l’appareil de transplantation, tournez le robinet d’arrêt à trois voies de manière à ce que son bras long fasse face à la pompe à microseringue et appuyez sur le piston de la seringue à réservoir pour évacuer toutes les bulles d’air de la conduite hydraulique. Maintenez une légère pression sur le piston (pour éviter le reflux d’air dans la conduite) et tournez le robinet d’arrêt à trois voies de manière à ce que son long bras fasse face à la seringue à réservoir.
5. Insérez l’aiguille dans le support en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air. Ajustez l’angle de l’aiguille de manière à ce qu’elle soit orientée directement vers la gauche à un angle de 10 à 15° par rapport à l’horizontale (Figure 3C).
6. À l’aide des micromanipulateurs grossiers et fins, on peut manœuvrer la pointe de l’aiguille sous l’objectif du microscope et la mettre au point (figure 3D).
   REMARQUE : Le positionnement grossier de l’aiguille dans les plans X et Y peut être effectué en observant directement la zone sous l’objectif pendant que vous manœuvrez l’aiguille, car l’aiguille réfléchira le faisceau de lumière transmise lorsqu’elle est positionnée sous l’objectif. Les oculaires du microscope peuvent ensuite être utilisés pour un positionnement précis. Ne réglez pas la position de la platine du microscope ou la mise au point pendant cette étape. Utilisez les micromanipulateurs pour amener la pointe de l’aiguille dans la position focale existante.
7. Si du liquide s’écoule à l’intérieur ou à l’extérieur de l’extrémité de l’aiguille, ajustez la pression à l’aide du pousse-seringue jusqu’à ce qu’un ménisque stable entre l’huile minérale et la solution de Ringer soit observé (figure 3D).
   REMARQUE : Si une bulle d’huile reste à la pointe de l’aiguille après la stabilisation, elle peut être retirée en utilisant le réglage du plan X sur le micromanipulateur grossier pour déplacer l’aiguille vers la droite jusqu’à ce que sa pointe ait été retirée du RPT, puis de nouveau vers la gauche jusqu’à ce qu’elle soit repositionnée sous l’objectif.

6. Transplantation

REMARQUE : Tous les mouvements de l’aiguille doivent être effectués à l’aide du micromanipulateur fin de cette section.

1. Déplacez la platine vers la droite jusqu’à ce que l’animal donneur soit ramené dans le champ de vision, en faisant attention d’éviter toute pénétration accidentelle avec l’aiguille.
2. Recentrez et concentrez-vous sur les cellules à transplanter et alignez l’aiguille avec les cellules situées juste à l’extérieur de l’animal (Figure 4A).
   REMARQUE : Vous devrez peut-être basculer souvent entre le fond clair et la fluorescence pour assurer un bon alignement. L’utilisation d’un filtre à densité neutre peut aider à visualiser les deux simultanément.
3. Insérez l’aiguille dans l’animal donneur.
   REMARQUE : Des mouvements répétés d’entrée et de sortie avec l’aiguille peuvent aider à pénétrer la peau.
4. Restabilisez immédiatement le ménisque d’huile dans la pointe de l’aiguille à l’aide de la pompe à microseringue, comme décrit à l’étape 5.7.
5. Positionnez la pointe de l’aiguille contre les cellules d’intérêt et appliquez une légère aspiration à l’aide de la pompe à microseringue (Figure 4B).
   REMARQUE : De légers mouvements d’entrée et de sortie pendant l’aspiration peuvent aider à desserrer les cellules.
6. Lorsqu’un nombre adéquat de cellules a été prélevé, retirez l’aiguille du donneur et stabilisez immédiatement le ménisque d’huile dans l’extrémité de l’aiguille à l’aide de la pompe à microseringue.
7. En prenant soin d’éviter de contacter les animaux ou l’agarose avec l’aiguille, repositionnez la platine pour faire apparaître le premier animal hôte.
8. Centrez et concentrez-vous sur la zone dans laquelle les cellules doivent être placées et alignez l’aiguille avec cette région juste à l’extérieur de l’animal (Figure 4C).
9. Insérez l’aiguille dans l’animal hôte et restabilisez immédiatement le ménisque d’huile dans la pointe de l’aiguille avec la pompe à microseringue.
10. Positionnez l’extrémité de l’aiguille dans le site de dépôt et appliquez une légère pression avec le tire-microseringue jusqu’à ce que le nombre correct de cellules donneuses soit libéré de l’aiguille (figure 4D).
    REMARQUE : Si les cellules du donneur et de l’hôte sont marquées avec des fluorophores différents, un filtre multibande permettant une visualisation simultanée peut être très utile à ce stade.
11. Retirez l’aiguille de l’hôte et stabilisez immédiatement le ménisque d’huile dans la pointe de l’aiguille à l’aide de la pompe à microseringue.
12. Répétez les étapes 6.7 à 6.11 pour tous les hôtes restants.

7. Récupération de l’animal hôte

1. Soulevez l’objectif 40x et utilisez le micromanipulateur grossier pour ramener l’aiguille en position de chargement.
   REMARQUE : L’aiguille peut être réutilisée pour plusieurs lames.
2. Retirez la lame du microscope de transplantation et placez-la sous un microscope de dissection.
3. Démontez les animaux hôtes en les retirant soigneusement de la chute LMA à l’aide d’une pince. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, transférez les animaux hôtes dans un plat contenant une solution fraîche de Ringer avec de la pénicilline/streptomycine. Assurez-vous que les animaux se remettent de l’anesthésie et maintenez-les dans un incubateur d’embryons jusqu’à ce qu’ils soient prêts à imager. Euthanasier les animaux donneurs selon les protocoles approuvés.
   REMARQUE : Notre méthode d’euthanasie consiste à immerger les animaux dans un bain de glace pendant au moins 1 heure, suivi d’une immersion dans de l’hypochlorite de sodium à 500 mg/L.

Résultats

Les résultats des expériences de transplantation sont directement observés en visualisant des cellules donneuses marquées par fluorescence chez des animaux hôtes à des moments appropriés après la transplantation à l’aide d’un microscope à fluorescence. Ici, nous avons transplanté des neurones vagues antérieurs individuels à 3 dpf. Les animaux hôtes ont ensuite été incubés pendant 12 ou 48 h, anesthésiés, montés dans le LMA sur une lamelle de verre et imagés au mi...

Discussion

Depuis plus d’un siècle, la biologie du développement et de la régénération s’appuie sur des expériences de transplantation pour examiner les principes de signalisation cellulaire et la détermination du destin cellulaire. Le modèle du poisson-zèbre représente déjà une puissante fusion d’approches génétiques et de transplantation. La transplantation aux stades de blastula et de gastrula pour générer des animaux en mosaïque est courante, mais limitée dans les types ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010