Transplantation cellulaire à haute résolution chez le poisson-zèbre embryonnaire et larvaire

Résumé

Nous présentons ici un protocole de transplantation de cellules à haute résolution spatiale et temporelle chez des embryons et des larves de poisson-zèbre à n’importe quel stade entre au moins 1 et 7 jours après la fécondation.

Résumé

Le développement et la régénération se produisent par un processus d’interactions cellulaires dynamiques, spatio-temporelles codées génétiquement. L’utilisation de la transplantation cellulaire entre animaux pour suivre le destin cellulaire et induire des décalages dans les propriétés génétiques, spatiales ou temporelles des cellules donneuses et hôtes est un moyen puissant d’examiner la nature de ces interactions. Des organismes tels que les poussins et les amphibiens ont apporté des contributions cruciales à notre compréhension du développement et de la régénération, respectivement, en grande partie en raison de leur facilité de transplantation. La puissance de ces modèles, cependant, a été limitée par une faible traçabilité génétique. De même, les principaux organismes modèles génétiques sont moins susceptibles d’être transplantés.

Le poisson-zèbre est un modèle génétique majeur pour le développement et la régénération, et bien que la transplantation cellulaire soit courante chez le poisson zèbre, elle est généralement limitée au transfert de cellules indifférenciées aux premiers stades de développement de la blastula et de la gastrula. Dans cet article, nous présentons une méthode simple et robuste qui permet d’étendre la fenêtre de transplantation du poisson-zèbre à tout stade embryonnaire ou larvaire entre au moins 1 et 7 jours après la fécondation. La précision de cette approche permet de transplanter aussi peu qu’une cellule avec une résolution spatiale et temporelle presque parfaite chez les animaux donneurs et hôtes. Bien que nous soulignions ici la transplantation de neurones embryonnaires et larvaires pour l’étude du développement et de la régénération nerveuses, respectivement, cette approche est applicable à un large éventail de types de cellules progénitrices et différenciées et de questions de recherche.

Introduction

La transplantation cellulaire a une longue et riche histoire en tant que technique fondamentale en biologie du développement. Au tournant du^{XXe siècle,} des approches utilisant des manipulations physiques pour perturber le processus de développement, y compris la transplantation, ont transformé l’embryologie d’une science d’observation en une science expérimentale ^1,2. Dans une expérience marquante, Hans Spemann et Hilde Mangold ont transplanté de manière ectopique la lèvre blastopore dorsale d’un embryon de salamandre sur le côté opposé d’un embryon hôte, induisant ....

Protocole

Tous les aspects de cette procédure qui concernent le travail avec des poissons-zèbres vivants ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Minnesota (IACUC) et sont effectués conformément aux directives de l’IACUC.

1. Configuration initiale unique de l’appareil de transplantation (Figure 1)

1. Assemblez le microscope de transplantation selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE : Ce protocole utilise un microscope à fluorescence vertical avec un objectif d’immersion d....

Discussion

Depuis plus d’un siècle, la biologie du développement et de la régénération s’appuie sur des expériences de transplantation pour examiner les principes de signalisation cellulaire et la détermination du destin cellulaire. Le modèle du poisson-zèbre représente déjà une puissante fusion d’approches génétiques et de transplantation. La transplantation aux stades de blastula et de gastrula pour générer des animaux en mosaïque est courante, mais limitée dans les types .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010