Трансплантация клеток высокого разрешения у эмбрионов и личинок рыбок данио рерио

Резюме

Здесь мы представляем протокол трансплантации клеток с высоким пространственным и временным разрешением эмбрионам и личинкам рыбок данио на любой стадии между как минимум 1 и 7 днями после оплодотворения.

Аннотация

Развитие и регенерация происходят в процессе генетически закодированных пространственно-временных динамических клеточных взаимодействий. Использование трансплантации клеток между животными для отслеживания судьбы клеток и выявления несоответствий в генетических, пространственных или временных свойствах донорских и родительских клеток является мощным средством изучения природы этих взаимодействий. Такие организмы, как цыплята и амфибии, внесли решающий вклад в наше понимание развития и регенерации, соответственно, в значительной степени из-за их податливости к трансплантации. Однако мощность этих моделей была ограничена низкой генетической управляемостью. Аналогичным образом, основные генетические модельные организмы имеют меньшую податливость к трансплантации.

Данио рерио является основной генетической моделью развития и регенерации, и хотя трансплантация клеток распространена у рыбок данио, она, как правило, ограничена переносом недифференцированных клеток на ранних стадиях развития бластулы и гаструлы. В этой статье мы представляем простой и надежный метод, который продлевает окно трансплантации данио-рерио до любой эмбриональной или личиночной стадии между как минимум 1 и 7 днями после оплодотворения. Точность этого подхода позволяет проводить трансплантацию всего одной клетки с почти идеальным пространственным и временным разрешением как у доноров, так и у животных-хозяев. Несмотря на то, что мы выделяем здесь трансплантацию эмбриональных и личиночных нейронов для изучения развития и регенерации нервов, соответственно, этот подход применим к широкому спектру типов клеток-предшественников и дифференцированных клеток и исследовательских вопросов.

Введение

Трансплантация клеток имеет долгую и легендарную историю как основополагающий метод в биологии развития. На рубеже^20-го века подходы с использованием физических манипуляций для нарушения процесса развития, включая трансплантацию, превратили эмбриологию из наблюдательной науки в^{экспериментальную.} В одном из знаковых экспериментов Ганс Шпеман и Хильде Мангольд эктопически пересадили дорсальную бластопорную губу эмбриона саламандры на противоположную сторону эмбриона-хозяина, заставив близлежащую ткань сформировать вторичную^{ось тела}. Этот эксперимент показал, что клетки могут побуждать другие клетки принимать определенную судьбу, и впоследствии трансплантация стала мощным методом для изучения критических вопросов в биологии развития, касающихся компетентности и определения судьбы клетки, клеточной линии, индуктивной способности, пластичности и активности стволовых ^{клеток.}

Более поздние научные достижения расширили возможности трансплантационного подхода. В 1969 году открытие Николь Ле Дуарен о том, что ядрышковое окрашивание может различать виды происхождения у химер перепелов и птенцов, позволило отслеживать трансплантированные клетки и их потомство^. Эта концепция была позже усилена появлением трансгенных флуоресцентных маркеров и^{передовых методов} визуализации5 и была использована для отслеживания судьбы клеток ^6,7, идентификации стволовых клеток и их активности ^8,9 и отслеживания движений клеток во время развития мозга¹⁰. Кроме того, развитие молекулярной генетики облегчило трансплантацию между хозяевами и донорами различных генотипов, способствуя точному препарированию автономных и неавтономных^{функций факторов развития}.

Трансплантация также внесла важный вклад в изучение регенерации, особенно у организмов с сильными регенеративными способностями, таких как планарии и аксолотли, прояснив клеточную идентичность и взаимодействия, которые регулируют рост и структуру регенерирующих тканей. Исследования трансплантации выявили принципы потенции¹², пространственного паттернинга^13,14, вклада конкретных тканей^15,16 и роли клеточной памяти^12,17 в регенерации.

Рыбки данио являются ведущей моделью позвоночных для изучения развития и регенерации, в том числе в нервной системе, благодаря их консервативным генетическим программам, высокой генетической управляемости, внешнему оплодотворению, большому размеру кладки и оптической прозрачности 18,19,20. Рыбки данио также хорошо поддаются трансплантации на ранних стадиях развития. Наиболее распространенным подходом является трансплантация клеток от меченого донорского эмбриона к эмбриону-хозяину на стадии бластулы или гаструлы для получения мозаичных животных. Клетки, трансплантированные на стадии бластулы, будут рассеиваться и рассеиваться в начале эпиболии, создавая мозаику меченых клеток и тканей по всему эмбриону²¹. Трансплантаты гаструл позволяют в некоторой степени нацеливаться на трансплантированные клетки в соответствии с приблизительной картой судьбы по мере формирования щита и определения осей A-P и D-V²¹. Полученные мозаики оказались полезными для определения того, действуют ли гены в клетке автономно, проверки приверженности клеток и картирования движения тканей и миграции клеток на протяжении всего развития ^5,11. Мозаичные рыбки данио рерио могут быть получены несколькими способами, включая электропорацию²², рекомбинацию²³, а также трансгенез F0²⁴ и мутагенез²⁵, но трансплантация обеспечивает наибольшую манипулируемость и точность в пространстве, времени, количестве и типах клеток. Современное состояние трансплантации рыбок данио в значительной степени ограничено клетками-предшественниками на ранних стадиях, за некоторыми исключениями, включая трансплантацию спинальных моторных нейронов^26,27, ганглиозных клеток сетчатки^28,29 и клеток нервного гребня в первые 10-30 ч после оплодотворения (ВПФ)³⁰, а также гемопоэтических и опухолевых клеток у взрослых рыбок данио-рерио ^5,31. Распространение методов трансплантации на широкий диапазон возрастов, стадий дифференцировки и типов клеток значительно усилит возможности этого подхода для понимания процессов развития и регенерации.

В этой статье мы демонстрируем гибкую и надежную технику трансплантации клеток с высоким разрешением, эффективную для эмбрионов и личинок рыбок данио-рерио в течение как минимум 7 дней после оплодотворения. Трансгенные рыбы-хозяева и доноры, экспрессирующие флуоресцентные белки в тканях-мишенях, могут быть использованы для извлечения одиночных клеток и их трансплантации с почти идеальным пространственным и временным разрешением. Оптическая прозрачность эмбрионов и личинок рыбок данио позволяет визуализировать трансплантированные клетки вживую по мере развития или регенерации животного-хозяина. Этот подход ранее использовался для изучения того, как пространственно-временная сигнальная динамика влияет на идентичность нейронов и направление аксонов у эмбриона³², а также для изучения логики, с помощью которой внутренние и внешние факторы способствуют управлению аксонами во время регенерации у личиночных рыб³³. Несмотря на то, что мы сосредоточились здесь на трансплантации дифференцированных нейронов, наш метод широко применим как к недифференцированным, так и к дифференцированным типам клеток на многих стадиях и тканях для решения вопросов развития и регенерации.

протокол

Все аспекты этой процедуры, относящиеся к работе с живыми рыбками данио, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Миннесоты и выполняются в соответствии с рекомендациями IACUC.

1. Однократная первичная настройка трансплантационного аппарата (Рисунок 1)

1. Соберите микроскоп для трансплантации в соответствии с инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется вертикальный флуоресцентный микроскоп с 40-кратным объективом для погружения в воду.
2. Соберите грубые и тонкие микроманипуляторы и установите их с правой стороны микроскопа в соответствии с инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку важно, чтобы предметный столик не двигался в размере Z относительно иглы, мы используем микроскоп с неподвижным предметным столиком с микроманипуляторами, установленными на основании микроскопа. Если микроскоп с неподвижным столиком недоступен, микроманипулятор можно установить на предметный столик.
3. Прикрепите держатель микроэлектрода к рукоятке электрода и установите на микроманипулятор.
4. Подсоедините одну сторону трехстороннего запорного крана к насосу для микрошприцев. Подсоедините другую сторону запорного крана к полиэтиленовой трубке с помощью хроматографического адаптера.
5. Подсоедините противоположную сторону полиэтиленовой трубки к держателю микроэлектродов с помощью хроматографического адаптера.
6. Наполните шприц емкостью 10 мл легким минеральным маслом и установите его на верхнюю сторону запорного крана.
7. Наполните микрошприцевой насос и трубку (гидравлическую линию) минеральным маслом из резервуара, убедившись, что все пузырьки воздуха удалены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как аппарат будет настроен, он потребует лишь периодического обслуживания гидравлической линии. Шприц резервуара может быть снят и при необходимости снова заполнен минеральным маслом.

2. Подготовьте подталкиватели эмбрионов.

1. Отрежьте кусок лески длиной 2 см и частично вставьте его в узкий конец наконечника пипетки P1000, оставив ~1,5 см открытым. Закрепите леску небольшой каплей суперклея и дайте высохнуть.

3. Приготовьте растворы.

1. Для приготовления 1% агарозы с низкой температурой плавления растворяют в зародышевой среде (LMA), растворяют агарозу в кипящей зародышевой среде³⁴. Внесите 1-2 мл аликвот в пробирки с круглым дном и храните при температуре 4 °C.
2. Приготовьте раствор Рингера с пенициллин-стрептомицином и трикаином (RPT), смешав следующие ингредиенты до конечных концентраций 116 мМ NaCl, 2,9 мМ KCl, 1,8 мМ CaCl2, 5 мМ HEPES pH 7,2, 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, перемешивая до растворения и пропуская через вакуумный фильтр. Хранить при комнатной температуре. Добавляйте трикаин непосредственно перед применением до концентрации 0,02%.

4. Подготовка донорских и принимающих животных к трансплантации.

1. Выращивание животных-хозяев и доноров с соответствующими генотипами и с флуоресцентно мечеными клетками до желаемого возраста.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих трансплантаций мы использовали Tg(isl1:EGFPCAAX)^fh474 животных-доноров³² и Tg(isl1:mRFP)^fh1 животных-хозяев³⁵ , а также трансплантировали нейроны от донора к моторным ядрам блуждающего нерва хозяина в 3dpf.
2. Подготовьте предметные стекла для трансплантации, нанеся прямоугольный контур прозрачного лака для ногтей на каждое стеклостекло (рисунок 2A). Лак для ногтей создает гидрофобный барьер для удержания RPT, добавленного в шаге 4.8. Дайте полностью высохнуть перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды могут быть подготовлены заранее и храниться неограниченное время.
3. Расплавьте одну аликвоту LMA, поместив пробирку с LMA в стакан объемом 50 мл, содержащий 40 мл воды, и разогрейте в микроволновой печи в течение 1 минуты при мощности 50% или до тех пор, пока он не растает. Поддерживайте LMA на уровне 40 °C в сухом нагревателе для ванны.
4. Дехорионатируйте животных-хозяев и доноров с помощью щипцов (если применимо) и обезболите их, поместив в маленькие чашки Петри, наполненные RPT комнатной температуры. Подождите 5 минут, пока животные полностью не будут обезболены, прежде чем продолжить.
5. Установка отдельных доноров и животных-хозяев: с помощью пипетки Пастера и дозатора переведите животных из RPT в LMA, а затем перенесите животных в небольших каплях LMA на предметные стекла в контуре лака для ногтей. Сведите к минимуму количество RPT, переносимого в LMA, чтобы LMA не разбавлялся. Прежде чем LMA затвердеет, используйте толкатель эмбрионов для ориентации животных, следя за тем, чтобы каждое животное было установлено так, чтобы предполагаемое место введения иглы было правым, а все животные были выровнены вертикально (Рисунок 2B); Дайте агарозе полностью застыть (~5 минут), прежде чем продолжить.
   Примечание: Поскольку у каждого животного-донора может быть взято много клеток, более эффективно установить 2-4 животных-хозяев с одним донором на каждом предметном стекле.
6. С помощью скальпеля разрежьте прямой вертикальный срез через все капли агарозы справа от установленных животных (Рисунок 2C). Удалите рыхлую агарозу со предметного стекла лабораторными салфетками.
7. С помощью скальпеля вырежьте клинья из агарозы, чтобы обнажить место введения иглы (Рисунок 2C). Удалите рыхлую агарозу со предметного стекла лабораторными салфетками.
8. Наносите RPT на предметное стекло до тех пор, пока агарозные капли не будут полностью погружены в воду (Рисунок 2D).
9. Закрепите подготовленное предметное стекло на микроскопе для трансплантации. Сфокусируйтесь на животном-доноре в соответствии с целью 40x. Для этого опустите объектив до тех пор, пока он не разорвет поверхность носителя, затем поднимите объектив в нужную фокальную плоскость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Контакт с жидкостью с мишенью должен сохраняться до тех пор, пока трансплантация не будет завершена (Рисунок 3C).
10. Сфокусируйтесь на флуоресцентно меченых донорских клетках, представляющих интерес; Затем сдвиньте ступень влево, чтобы подготовиться к нахождению иглы для трансплантации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе не настраивайте микроскоп по осям Y или Z, чтобы убедиться, что вы сможете легко найти животное-донора в разделе 5.

5. Подготовьте иглу для пересадки.

1. Вставьте микропипетку в съемник микропипетки и потяните иглу для микроинъекций.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Форма иглы должна быть аналогична той, которая используется для инъекций эмбрионов данио-рерио на 1-клеточной стадии или зажима пластыря. Мы используем съемник микропипеток со следующей программой: ДАВЛЕНИЕ = 500, ТЕПЛО = нарастание + 80, ВЫТЯГИВАНИЕ = 90, СКОРОСТЬ = 70, ВРЕМЯ = 250 (см. Таблицу материалов), хотя правильные настройки для каждого съемника, вероятно, потребуется определить опытным путем.
2. Совместите кончик иглы с делениями микрометра предметного стекла под рассекающим эндоскопом. Используя микрометр в качестве ориентира для измерения, используйте заточенную пару щипцов, чтобы сломать иглу до размера отверстия, который немного больше диаметра интересующих клеток (рисунок 3A). Следите за тем, чтобы излом был максимально чистым, так как неровные края могут способствовать засорению иглой. ПРИМЕЧАНИЕ: Для блуждающих двигательных нейронов (диаметр 5-7 мкм) иглы должны быть сломаны до внутреннего диаметра 10 мкм, что соответствует внешнему диаметру 20 мкм. При необходимости размер, форма и/или угол наклона кончика иглы могут быть уточнены с помощью микрокузницы или микрошлифовального станка³⁶.
3. С помощью шприца объемом 50 мл, наполненного легким минеральным маслом и снабженного наполнителем для пипетки, полностью заполните иглу минеральным маслом (рисунок 3В). Следите за тем, чтобы не было пузырьков воздуха. Отложите заполненную иглу в сторону до готовности к монтажу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха, вставьте наполнитель пипетки до упора в иглу и выпустите масло, медленно вытягивая наполнитель из иглы.
4. На аппарате для трансплантации поверните трехсторонний запорный кран так, чтобы его длинная рука была обращена к насосу микрошприца, и нажмите на поршень шприца-резервуара, чтобы выдуть все пузырьки воздуха из гидравлической магистрали. Поддерживайте легкое давление на поршень (чтобы предотвратить обратный поток воздуха в линию) и поверните трехсторонний запорный кран так, чтобы его длинная рука была обращена к шприцу резервуара.
5. Вставьте иглу в держатель, стараясь не допустить попадания пузырьков воздуха. Отрегулируйте угол наклона иглы так, чтобы она была направлена прямо влево под углом 10-15° от горизонтали (рисунок 3C).
6. С помощью грубых и тонких микроманипуляторов маневрируйте кончиком иглы под объективом микроскопа и сфокусируйте его (Рисунок 3D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Грубое позиционирование иглы в плоскостях X и Y может быть выполнено путем непосредственного наблюдения за областью под объективом во время маневрирования иглой, так как игла будет отражать проходящий световой луч, когда она находится под объективом. Окуляры микроскопа затем можно использовать для точного позиционирования. Не регулируйте положение предметного столика или фокусировку микроскопа во время этого шага. С помощью микроманипуляторов нужно привести кончик иглы в исходное положение.
7. Если жидкость поступает внутрь иглы или выходит из него, отрегулируйте давление с помощью шприцевого насоса до тех пор, пока не будет наблюдаться стабильный мениск между минеральным маслом и раствором Рингера (Рисунок 3D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если масляный пузырь остается на кончике иглы после стабилизации, его можно удалить с помощью регулировки плоскости X на грубом микроманипуляторе, чтобы переместить иглу вправо до тех пор, пока ее кончик не будет извлечен из RPT, а затем обратно влево до тех пор, пока она не будет перемещена под объектив.

6. Трансплантация

ПРИМЕЧАНИЕ: Все движения иглой должны выполняться с помощью тонкого микроманипулятора для этого участка.

1. Перемещайте ступень вправо до тех пор, пока донорское животное не будет возвращено в поле зрения, соблюдая осторожность, чтобы избежать случайного проникновения иглой.
2. Перецентрируйте и сосредоточьтесь на клетках, подлежащих трансплантации, и выровняйте иглу с клетками, находящимися непосредственно за животным (рисунок 4A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, вам придется часто переключаться между светлым полем и флуоресценцией, чтобы обеспечить правильное выравнивание. Использование фильтра нейтральной плотности может помочь в одновременной визуализации и того, и другого.
3. Введите иглу в донорское животное.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторяющиеся движения иглой внутрь и наружу могут помочь в проникновении в кожу.
4. Немедленно стабилизируйте масляный мениск на кончике иглы с помощью микрошприцевого насоса, как описано в шаге 5.7.
5. Прижмите кончик иглы к интересующим клеткам и осторожно отсосите с помощью микрошприцевого насоса (Рисунок 4B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкие движения внутрь и наружу во время отсасывания могут помочь ослабить клетки.
6. Когда будет взято достаточное количество клеток, извлеките иглу у донора и немедленно восстановите масляный мениск на кончике иглы с помощью микрошприцевого насоса.
7. Соблюдая осторожность, чтобы не соприкасаться с животными или агарозой с иглой, переместите сцену так, чтобы в поле зрения попало первое животное-хозяин.
8. Центрируйте и сосредоточьтесь на области, в которой должны быть размещены клетки, и выровняйте иглу с этой областью, находящейся непосредственно за животным (рисунок 4C).
9. Введите иглу в животное-хозяина и немедленно восстановите масляный мениск на кончике иглы с помощью микрошприцевого насоса.
10. Расположите кончик иглы в месте осаждения и слегка надавите на него с помощью микрошприцевого насоса до тех пор, пока из иглы не будет высвобождено нужное количество донорских клеток (Рисунок 4D).
    Примечание: Если донорские и хозяйские клетки помечены разными флуорофорами, многополосный фильтр для одновременной визуализации может быть очень полезен на этом этапе.
11. Извлеките иглу из хозяина и немедленно восстановите масляный мениск на кончике иглы с помощью микрошприцевого насоса.
12. Повторите шаги 6.7-6.11 для всех оставшихся узлов сети.

7. Восстановление животного-хозяина

1. Поднимите объектив 40x и с помощью грубого микроманипулятора переместите иглу обратно в положение загрузки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Иглу можно повторно использовать для нескольких слайдов.
2. Снимите предметное стекло с трансплантологического микроскопа и поместите его под микроскоп для препарирования.
3. Снимите животных-хозяев, осторожно сняв их с капли LMA с помощью щипцов. С помощью стеклянной пастеровской пипетки переложите животных-хозяев в чашку со свежим раствором Рингера с пенициллином/стрептомицином. Убедитесь, что животные восстанавливаются после анестезии, и поддерживайте их в инкубаторе для эмбрионов до тех пор, пока они не будут готовы к визуализации. Усыпляйте животных-доноров в соответствии с утвержденными протоколами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Наш метод эвтаназии заключается в погружении животных в ледяную ванну не менее чем на 1 час с последующим погружением в гипохлорит натрия 500 мг/л.

Результаты

Результаты экспериментов по трансплантации непосредственно наблюдаются путем визуализации флуоресцентно меченых донорских клеток у животных-хозяев в соответствующие моменты времени после трансплантации с помощью флуоресцентного микроскопа. Здесь мы пересадили ?...

Обсуждение

Биология развития и регенеративная биология уже более ста лет опирается на эксперименты по трансплантации для изучения принципов клеточной сигнализации и определения клеточной судьбы. Модель рыбок данио уже представляет собой мощное слияние генетического и трансп...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010