Трансплантация клеток высокого разрешения у эмбрионов и личинок рыбок данио рерио

Резюме

Здесь мы представляем протокол трансплантации клеток с высоким пространственным и временным разрешением эмбрионам и личинкам рыбок данио на любой стадии между как минимум 1 и 7 днями после оплодотворения.

Аннотация

Развитие и регенерация происходят в процессе генетически закодированных пространственно-временных динамических клеточных взаимодействий. Использование трансплантации клеток между животными для отслеживания судьбы клеток и выявления несоответствий в генетических, пространственных или временных свойствах донорских и родительских клеток является мощным средством изучения природы этих взаимодействий. Такие организмы, как цыплята и амфибии, внесли решающий вклад в наше понимание развития и регенерации, соответственно, в значительной степени из-за их податливости к трансплантации. Однако мощность этих моделей была ограничена низкой генетической управляемостью. Аналогичным образом, основные генетические модельные организмы имеют меньшую податливость к трансплантации.

Данио рерио является основной генетической моделью развития и регенерации, и хотя трансплантация клеток распространена у рыбок данио, она, как правило, ограничена переносом недифференцированных клеток на ранних стадиях развития бластулы и гаструлы. В этой статье мы представляем простой и надежный метод, который продлевает окно трансплантации данио-рерио до любой эмбриональной или личиночной стадии между как минимум 1 и 7 днями после оплодотворения. Точность этого подхода позволяет проводить трансплантацию всего одной клетки с почти идеальным пространственным и временным разрешением как у доноров, так и у животных-хозяев. Несмотря на то, что мы выделяем здесь трансплантацию эмбриональных и личиночных нейронов для изучения развития и регенерации нервов, соответственно, этот подход применим к широкому спектру типов клеток-предшественников и дифференцированных клеток и исследовательских вопросов.

Введение

Трансплантация клеток имеет долгую и легендарную историю как основополагающий метод в биологии развития. На рубеже^20-го века подходы с использованием физических манипуляций для нарушения процесса развития, включая трансплантацию, превратили эмбриологию из наблюдательной науки в^{экспериментальную.} В одном из знаковых экспериментов Ганс Шпеман и Хильде Мангольд эктопически пересадили дорсальную бластопорную губу эмбриона саламандры на противоположную сторону эмбриона-хозяина, заставив близлежащую ткань сформировать вторичную^{ось тела}. Этот экспер....

протокол

Все аспекты этой процедуры, относящиеся к работе с живыми рыбками данио, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Миннесоты и выполняются в соответствии с рекомендациями IACUC.

1. Однократная первичная настройка трансплантационного аппарата (Рисунок 1)

1. Соберите микроскоп для трансплантации в соответствии с инструкциями производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется вертикальный флуоресцентный микроскоп с 40-кратным объективом для погружения в воду.
2. Соберите грубые и т....

Результаты

Результаты экспериментов по трансплантации непосредственно наблюдаются путем визуализации флуоресцентно меченых донорских клеток у животных-хозяев в соответствующие моменты времени после трансплантации с помощью флуоресцентного микроскопа. Здесь мы пересадили ?.......

Обсуждение

Биология развития и регенеративная биология уже более ста лет опирается на эксперименты по трансплантации для изучения принципов клеточной сигнализации и определения клеточной судьбы. Модель рыбок данио уже представляет собой мощное слияние генетического и трансп.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010