Trasplante celular de alta resolución en embriones y larvas de pez cebra

Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo para trasplantar células con alta resolución espacial y temporal en embriones y larvas de pez cebra en cualquier etapa entre al menos 1 y 7 días después de la fertilización.

Resumen

El desarrollo y la regeneración se producen mediante un proceso de interacciones celulares dinámicas espacio-temporales codificadas genéticamente. El uso del trasplante de células entre animales para rastrear el destino de las células e inducir desajustes en las propiedades genéticas, espaciales o temporales de las células del donante y del huésped es un medio poderoso para examinar la naturaleza de estas interacciones. Organismos como los pollitos y los anfibios han hecho contribuciones cruciales a nuestra comprensión del desarrollo y la regeneración, respectivamente, en gran parte debido a su susceptibilidad al trasplante. El poder de estos modelos, sin embargo, se ha visto limitado por la baja trazabilidad genética. Del mismo modo, los principales organismos modelo genéticos tienen menor susceptibilidad al trasplante.

El pez cebra es un modelo genético importante para el desarrollo y la regeneración, y aunque el trasplante de células es común en el pez cebra, generalmente se limita a la transferencia de células indiferenciadas en las primeras etapas de desarrollo de la blástula y la gástrula. En este artículo, presentamos un método simple y robusto que extiende la ventana de trasplante de pez cebra a cualquier etapa embrionaria o larvaria entre al menos 1 y 7 días después de la fertilización. La precisión de este enfoque permite el trasplante de tan solo una célula con una resolución espacial y temporal casi perfecta tanto en animales donantes como huéspedes. Si bien destacamos aquí el trasplante de neuronas embrionarias y larvales para el estudio del desarrollo y la regeneración nerviosa, respectivamente, este enfoque es aplicable a una amplia gama de tipos de células progenitoras y diferenciadas y preguntas de investigación.

Introducción

El trasplante de células tiene una larga historia como técnica fundamental en la biología del desarrollo. A principios^{del siglo XX}, los enfoques que utilizaban manipulaciones físicas para perturbar el proceso de desarrollo, incluido el trasplante, transformaron la embriología de una ciencia observacional en una experimental ^1,2. En un experimento histórico, Hans Spemann y Hilde Mangold trasplantaron ectópicamente el labio dorsal de blastoporo de un embrión de salamandra al lado opuesto de un embrión huésped, induciendo el tejido cercano a formar un eje corporal secundario³. Este experimento demostró que las células podían inducir a otras células a adoptar ciertos destinos y, posteriormente, el trasplante se desarrolló como un método poderoso para interrogar preguntas críticas en biología del desarrollo con respecto a la competencia y la determinación del destino celular, el linaje celular, la capacidad inductiva, la plasticidad y la potencia de las células madre ^1,4,5.

Los avances científicos más recientes han ampliado el poder del enfoque de trasplante. En 1969, el descubrimiento de Nicole Le Douarin de que la tinción nucleolar podía distinguir las especies de origen en las quimeras de los polluelos de codorniz permitió el seguimiento de las células trasplantadas y su progenie⁶. Este concepto fue posteriormente potenciado por el advenimiento de los marcadores fluorescentes transgénicos y las técnicas avanzadas de imagen⁵, y ha sido aprovechado para rastrear el destino de las células ^6,7, identificar las células madre y su potencia ^8,9 y rastrear los movimientos celulares durante el desarrollo del cerebro¹⁰. Además, el auge de la genética molecular facilitó el trasplante entre huéspedes y donantes de genotipos distintos, lo que permitió una disección precisa de las funciones autónomas y no autónomas de los factores de desarrollo¹¹.

El trasplante también ha hecho contribuciones importantes al estudio de la regeneración, particularmente en organismos con fuertes capacidades regenerativas como las planarias y el ajolote, al dilucidar las identidades celulares y las interacciones que regulan el crecimiento y el patrón de los tejidos en regeneración. Los estudios de trasplante han revelado los principios de la potencia¹², el patrón espacial^13,14, las contribuciones de tejidos específicos^15,16 y el papel de la memoria celular^12,17 en la regeneración.

El pez cebra es un modelo de vertebrado líder para el estudio del desarrollo y la regeneración, incluso en el sistema nervioso, debido a sus programas genéticos conservados, alta manejabilidad genética, fertilización externa, gran tamaño de nidada y claridad óptica 18,19,20. El pez cebra también es muy susceptible al trasplante en las primeras etapas de desarrollo. El enfoque más destacado es el trasplante de células de un embrión donante marcado a un embrión huésped en la etapa de blástula o gástrula para generar animales en mosaico. Las células trasplantadas durante la etapa de blástula se dispersarán y dispersarán a medida que comienza la epibolía, produciendo un mosaico de células y tejidos marcados a lo largo del embrión²¹. Los trasplantes de gástrula permiten seleccionar las células trasplantadas de acuerdo con un mapa de destino aproximado a medida que se forma el escudo y se pueden determinar los ejes A-P y D-V²¹. Los mosaicos resultantes han sido valiosos para determinar si los genes actúan de forma autónoma de las células, probar el compromiso celular y mapear el movimiento de los tejidos y la migración celular a lo largo del desarrollo ^5,11. El pez cebra mosaico se puede generar de varias maneras, incluida la electroporación²², la recombinación²³ y la transgénesis F0²⁴ y la mutagénesis²⁵, pero el trasplante proporciona la mayor manipulabilidad y precisión en el espacio, el tiempo y el número y los tipos de células. El estado actual del trasplante de pez cebra se limita en gran medida a las células progenitoras en etapas tempranas, con algunas excepciones que incluyen el trasplante de neuronas motoras espinales^26,27, células ganglionares de la retina^28,29 y células de la cresta neural en las primeras 10-30 h después de la fertilización (hpf)³⁰, y de células hematopoyéticas y tumorales en peces cebra adultos ^5,31. La expansión de los métodos de trasplante a una amplia gama de edades, etapas de diferenciación y tipos de células mejoraría en gran medida el poder de este enfoque para proporcionar información sobre los procesos de desarrollo y regeneración.

Aquí, demostramos una técnica flexible y robusta para el trasplante de células de alta resolución efectiva en embriones y larvas de pez cebra hasta al menos 7 días después de la fertilización. Los peces transgénicos huéspedes y donantes que expresan proteínas fluorescentes en los tejidos diana pueden utilizarse para extraer células individuales y trasplantarlas con una resolución espacial y temporal casi perfecta. La claridad óptica de los embriones y larvas de pez cebra permite obtener imágenes de las células trasplantadas en vivo a medida que el animal huésped se desarrolla o se regenera. Este enfoque se ha utilizado previamente para examinar cómo la dinámica de señalización espacio-temporal influye en la identidad neuronal y la guía de los axones en el embrión³², y para examinar la lógica por la cual los factores intrínsecos y extrínsecos promueven la guía de los axones durante la regeneración en las larvas^{de peces 33}. Si bien nos centramos aquí en el trasplante de neuronas diferenciadas, nuestro método es ampliamente aplicable tanto a tipos de células indiferenciadas como diferenciadas en muchas etapas y tejidos para abordar cuestiones de desarrollo y regeneración.

Protocolo

Todos los aspectos de este procedimiento relacionados con el trabajo con peces cebra vivos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Minnesota (IACUC) y se realizan de acuerdo con las pautas de IACUC.

1. Configuración inicial única del aparato de trasplante (Figura 1)

1. Ensamble el microscopio para trasplantes según las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Este protocolo utiliza un microscopio de fluorescencia vertical con un objetivo de inmersión en agua de 40x.
2. Ensamble los micromanipuladores gruesos y finos y móntelos en el lado derecho del microscopio de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Debido a que es importante que la platina no se mueva en la dimensión Z en relación con la aguja, utilizamos un microscopio de platina fija con los micromanipuladores montados en la base del microscopio. Si no se dispone de un microscopio de platina fija, el micromanipulador puede montarse en la platina.
3. Conecte el soporte de microelectrodo al mango del electrodo y móntelo en el micromanipulador.
4. Conecte un lado de la llave de paso de tres vías a la bomba de microjeringa. Conecte el otro lado de la llave de paso al tubo de polietileno mediante el adaptador de cromatografía.
5. Conecte el lado opuesto del tubo de polietileno al soporte de microelectrodos mediante el adaptador de cromatografía.
6. Llene la jeringa del depósito de 10 ml con aceite mineral ligero y móntela en la parte superior de la llave de paso.
7. Llene la bomba de microjeringa y el tubo (la línea hidráulica) con aceite mineral del depósito, asegurándose de eliminar todas las burbujas de aire.
   NOTA: Una vez que el aparato esté configurado, solo requerirá un mantenimiento ocasional de la línea hidráulica. La jeringa del depósito se puede quitar y volver a llenar con aceite mineral según sea necesario.

2. Prepara empujadores de embriones.

1. Corta un trozo de hilo de pescar de 2 cm e insértalo parcialmente en el extremo estrecho de la punta de una pipeta P1000, dejando ~1,5 cm expuesto. Asegure el hilo de pescar con una pequeña gota de superpegamento y déjelo secar.

3. Preparar soluciones.

1. Para preparar agarosa de bajo punto de fusión al 1% disuelta en medios embrionarios (LMA), disuelva la agarosa en medios embrionarios hirviendo³⁴. Prepare alícuotas de 1-2 ml en tubos de ensayo de fondo redondo y almacene a 4 °C.
2. Prepare la solución de Ringer con penicilina-estreptomicina y tricaína (RPT) combinando los siguientes ingredientes hasta concentraciones finales de 116 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM de HEPES pH 7,2, 50 unidades/mL de penicilina y 50ug/mL de estreptomicina, agitando hasta que se disuelva y pasando por un filtro de vacío. Almacene a temperatura ambiente. Añadir tricaína inmediatamente antes de usar hasta una concentración del 0,02%.

4. Preparar a los animales donantes y huéspedes para el trasplante.

1. Criar animales hospedadores y donantes de los genotipos apropiados, y con células de interés marcadas con fluorescencia, hasta la edad deseada.
   NOTA: Para estos trasplantes, utilizamos animales donantes Tg(isl1:EGFPCAAX)^{fh474 32} y Tg(isl1:mRFP)^{fh1 35} y neuronas trasplantadas de núcleo motor vago del donante al huésped a 3dpf.
2. Prepare los portaobjetos de trasplante aplicando un contorno rectangular de esmalte de uñas transparente a cada portaobjetos de vidrio (Figura 2A). El esmalte de uñas crea una barrera hidrofóbica para retener el RPT agregado en el paso 4.8. Deje que se seque completamente antes de usar.
   NOTA: Las diapositivas se pueden preparar con anticipación y almacenar indefinidamente.
3. Derrita una alícuota de LMA colocando un tubo de LMA en un vaso de precipitados de 50 ml que contenga 40 ml de agua y cocinando en el microondas durante 1 minuto al 50% de potencia o hasta que se derrita. Mantenga el LMA a 40 °C en un calentador de baño seco.
4. Decorionar a los animales huéspedes y donantes con fórceps (si corresponde) y anestesiarlos colocándolos en pequeñas placas de Petri llenas de RPT a temperatura ambiente. Espere 5 minutos para que los animales estén completamente anestesiados antes de continuar.
5. Montaje individual de animales donantes y huéspedes: Con la pipeta Pasteur y la bomba de pipeta, transfiera los animales de RPT a LMA, luego transfiera a los animales en pequeñas gotas de LMA a portaobjetos dentro del contorno del esmalte de uñas. Minimice la cantidad de RPT transferido a la LMA para que la LMA no se diluya. Antes de que el LMA se solidifique, use un empujador de embriones para orientar a los animales, asegurándose de que cada animal esté montado con el sitio de inserción de la aguja previsto hacia la derecha, y que todos los animales estén alineados verticalmente (Figura 2B); Deje que la agarosa se asiente por completo (~ 5 min) antes de continuar.
   NOTA: Debido a que se pueden tomar muchas células de cada animal donante, es más eficiente montar de 2 a 4 animales huéspedes con un donante en cada portaobjetos.
6. Con un bisturí, corte una rodaja vertical recta a través de todas las gotas de agarosa justo a la derecha de los animales montados (Figura 2C). Retire la agarosa suelta del portaobjetos con toallitas de laboratorio.
7. Con un bisturí, corte gajos de la agarosa para exponer el sitio de inserción de la aguja (Figura 2C). Retire la agarosa suelta del portaobjetos con toallitas de laboratorio.
8. Aplique RPT al portaobjetos hasta que las gotas de agarosa estén completamente sumergidas (Figura 2D).
9. Monte el portaobjetos preparado en el microscopio de trasplante. Enfoca al animal donante bajo el objetivo 40x. Para hacer esto, baje el objetivo hasta que rompa la superficie del medio, luego eleve el objetivo al plano focal deseado.
   NOTA: El contacto líquido con el objetivo debe mantenerse hasta que se complete el trasplante (Figura 3C).
10. Enfocar las células del donante marcadas con fluorescencia de interés; Luego, mueva la etapa hacia la izquierda en preparación para ubicar la aguja de trasplante.
    NOTA: En este punto, no ajuste el microscopio en los ejes Y o Z, para asegurarse de que puede volver a encontrar fácilmente al animal donante en la sección 5.

5. Prepare la aguja de trasplante.

1. Inserte una micropipeta en el extractor de micropipetas y tire de una aguja de microinyección.
   NOTA: La forma de la aguja debe ser similar a la utilizada para las inyecciones de embriones de pez cebra en etapa de 1 célula o el pinzamiento del parche. Utilizamos un extractor de micropipetas con el siguiente programa: PRESIÓN = 500, CALOR = rampa + 80, TRACCIÓN = 90, VELOCIDAD = 70, TIEMPO = 250 (consulte la Tabla de materiales), aunque es probable que sea necesario determinar empíricamente los ajustes correctos para cada extractor.
2. Alinee la punta de la aguja con las divisiones del micrómetro de la etapa bajo un endoscopio de disección. Usando el micrómetro como guía de medición, use un par de pinzas afiladas para romper la aguja a un tamaño de orificio que sea ligeramente mayor que el diámetro de las células de interés (Figura 3A). Asegúrese de que la rotura esté lo más limpia posible, ya que los bordes irregulares pueden contribuir a la obstrucción de la aguja. NOTA: Para las neuronas motoras vagas (5-7 μm de diámetro), las agujas deben romperse hasta un diámetro interior de 10 μm, que corresponde a un diámetro exterior de 20 μm. Si es necesario, el tamaño, la forma y/o el ángulo de la punta de la aguja se pueden refinar con un microforge o un microgrinder³⁶.
3. Con una jeringa de 50 ml llena de aceite mineral ligero y equipada con un llenador de pipetas, llene completamente la aguja con aceite mineral (Figura 3B). Asegúrese de que no haya burbujas de aire. Deje la aguja llena a un lado hasta que esté lista para el montaje.
   NOTA: Para asegurarse de que no haya burbujas de aire, inserte el relleno de pipeta completamente en la aguja y libere aceite mientras saca lentamente el relleno de la aguja.
4. En el aparato de trasplante, gire la llave de paso de tres vías de modo que su brazo largo mire hacia la bomba de microjeringa y presione el émbolo de la jeringa del depósito para eliminar todas las burbujas de aire de la línea hidráulica. Mantenga una ligera presión sobre el émbolo (para evitar el reflujo de aire en la línea) y gire la llave de paso de tres vías de modo que su brazo largo mire hacia la jeringa del depósito.
5. Inserte la aguja en el soporte, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire. Ajuste el ángulo de la aguja de modo que mire directamente hacia la izquierda en un ángulo de 10-15° con respecto a la horizontal (Figura 3C).
6. Utilice los micromanipuladores gruesos y finos para maniobrar la punta de la aguja bajo el objetivo del microscopio y enfocarla (Figura 3D).
   NOTA: El posicionamiento aproximado de la aguja en los planos X e Y se puede realizar observando directamente el área debajo del objetivo mientras maniobra la aguja, ya que la aguja reflejará el haz de luz transmitido cuando se coloque debajo del objetivo. A continuación, se pueden utilizar los oculares de microscopio para un posicionamiento preciso. No ajuste la posición ni el enfoque de la platina del microscopio durante este paso. Utilice los micromanipuladores para colocar la punta de la aguja en la posición focal existente.
7. Si el líquido fluye hacia adentro o hacia afuera de la punta de la aguja, ajuste la presión con la bomba de jeringa hasta que se observe un menisco estable entre el aceite mineral y la solución de Ringer (Figura 3D).
   NOTA: Si queda una burbuja de aceite en la punta de la aguja después de la estabilización, se puede eliminar utilizando el ajuste del plano X en el micromanipulador grueso para mover la aguja hacia la derecha hasta que su punta se haya retirado del RPT, luego nuevamente a la izquierda hasta que se reposicione debajo del objetivo.

6. Trasplante

NOTA: Todos los movimientos de la aguja deben realizarse utilizando el micromanipulador fino para esta sección.

1. Mueva la platina hacia la derecha hasta que el animal donante vuelva a estar a la vista, teniendo cuidado de evitar la penetración accidental con la aguja.
2. Vuelva a centrar y concéntrese en las células que se van a trasplantar y alinee la aguja con las células que se encuentran justo fuera del animal (Figura 4A).
   NOTA: Es posible que deba cambiar entre campo claro y fluorescencia con frecuencia para garantizar una alineación adecuada. El uso de un filtro de densidad neutra puede ayudar a visualizar ambos simultáneamente.
3. Inserte la aguja en el animal donante.
   NOTA: Los movimientos repetidos hacia adentro y hacia afuera con la aguja pueden ayudar a penetrar la piel.
4. Vuelva a estabilizar inmediatamente el menisco oleoso en la punta de la aguja con la bomba de microjeringa, como se describe en el paso 5.7.
5. Coloque la punta de la aguja contra las células de interés y aplique una succión suave con la bomba de microjeringa (Figura 4B).
   NOTA: Los movimientos suaves hacia adentro y hacia afuera durante la succión pueden ayudar a aflojar las células.
6. Cuando se haya extraído un número adecuado de células, retire la aguja del donante y vuelva a estabilizar inmediatamente el menisco oleoso en la punta de la aguja con la bomba de microjeringa.
7. Teniendo cuidado de evitar el contacto de los animales o la agarosa con la aguja, vuelva a colocar el escenario para que quede a la vista el primer animal huésped.
8. Centre y concéntrese en el área en la que se colocarán las células y alinee la aguja con esta región justo fuera del animal (Figura 4C).
9. Inserte la aguja en el animal huésped e inmediatamente vuelva a estabilizar el menisco oleoso en la punta de la aguja con la bomba de microjeringa.
10. Coloque la punta de la aguja en el sitio de deposición y aplique una presión suave con la bomba de microjeringa hasta que se libere el número correcto de células donantes de la aguja (Figura 4D).
    NOTA: Si las células del donante y del huésped están marcadas con fluoróforos diferentes, un filtro multibanda para permitir la visualización simultánea puede ser muy útil en esta etapa.
11. Retire la aguja del huésped y vuelva a estabilizar inmediatamente el menisco oleoso en la punta de la aguja con la bomba de microjeringa.
12. Repita los pasos 6.7-6.11 para todos los hosts restantes.

7. Recuperación del animal huésped

1. Eleve el objetivo 40x y use el micromanipulador grueso para maniobrar la aguja de regreso a la posición de carga.
   NOTA: La aguja se puede reutilizar para varios portaobjetos.
2. Retire el portaobjetos del microscopio de trasplante y colóquelo bajo un microscopio de disección.
3. Desmonte a los animales huéspedes retirándolos con cuidado de la caída LMA con pinzas. Con una pipeta Pasteur de vidrio, transfiera los animales huéspedes a un plato con solución fresca de Ringer con penicilina/estreptomicina. Asegúrese de que los animales se recuperen de la anestesia y manténgalos en una incubadora de embriones hasta que estén listos para tomar imágenes. Sacrificar a los animales donantes de acuerdo con los protocolos aprobados.
   NOTA: Nuestro método para la eutanasia consiste en sumergir a los animales en un baño de hielo durante al menos 1 hora, seguido de una inmersión en 500 mg/L de hipoclorito de sodio.

Resultados

Los resultados de los experimentos de trasplante se observan directamente mediante la visualización de células donantes marcadas con fluorescencia en animales huéspedes en los momentos apropiados después del trasplante utilizando un microscopio de fluorescencia. Aquí, trasplantamos neuronas vagas anteriores individuales a 3 dpf. A continuación, se incubaron los animales huéspedes durante 12 o 48 h, se anestesiaron, se montaron en LMA en un cubreobjetos de vidrio y se obtuvieron im...

Discusión

Durante más de un siglo, la biología del desarrollo y la regeneración se ha basado en experimentos de trasplante para examinar los principios de la señalización celular y la determinación del destino celular. El modelo del pez cebra ya representa una poderosa fusión de enfoques genéticos y de trasplante. El trasplante en las etapas de blástula y gástrula para generar animales en mosaico es común, pero limitado en cuanto a los tipos de preguntas que puede abordar. El trasplante...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010