Trasplante celular de alta resolución en embriones y larvas de pez cebra

Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo para trasplantar células con alta resolución espacial y temporal en embriones y larvas de pez cebra en cualquier etapa entre al menos 1 y 7 días después de la fertilización.

Resumen

El desarrollo y la regeneración se producen mediante un proceso de interacciones celulares dinámicas espacio-temporales codificadas genéticamente. El uso del trasplante de células entre animales para rastrear el destino de las células e inducir desajustes en las propiedades genéticas, espaciales o temporales de las células del donante y del huésped es un medio poderoso para examinar la naturaleza de estas interacciones. Organismos como los pollitos y los anfibios han hecho contribuciones cruciales a nuestra comprensión del desarrollo y la regeneración, respectivamente, en gran parte debido a su susceptibilidad al trasplante. El poder de estos modelos, sin embargo, se ha visto limitado por la baja trazabilidad genética. Del mismo modo, los principales organismos modelo genéticos tienen menor susceptibilidad al trasplante.

El pez cebra es un modelo genético importante para el desarrollo y la regeneración, y aunque el trasplante de células es común en el pez cebra, generalmente se limita a la transferencia de células indiferenciadas en las primeras etapas de desarrollo de la blástula y la gástrula. En este artículo, presentamos un método simple y robusto que extiende la ventana de trasplante de pez cebra a cualquier etapa embrionaria o larvaria entre al menos 1 y 7 días después de la fertilización. La precisión de este enfoque permite el trasplante de tan solo una célula con una resolución espacial y temporal casi perfecta tanto en animales donantes como huéspedes. Si bien destacamos aquí el trasplante de neuronas embrionarias y larvales para el estudio del desarrollo y la regeneración nerviosa, respectivamente, este enfoque es aplicable a una amplia gama de tipos de células progenitoras y diferenciadas y preguntas de investigación.

Introducción

El trasplante de células tiene una larga historia como técnica fundamental en la biología del desarrollo. A principios^{del siglo XX}, los enfoques que utilizaban manipulaciones físicas para perturbar el proceso de desarrollo, incluido el trasplante, transformaron la embriología de una ciencia observacional en una experimental ^1,2. En un experimento histórico, Hans Spemann y Hilde Mangold trasplantaron ectópicamente el labio dorsal de blastoporo de un embrión de salamandra al lado opuesto de un embrión huésped, induciendo el tejido cercano a formar un eje corporal secu....

Protocolo

Todos los aspectos de este procedimiento relacionados con el trabajo con peces cebra vivos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Minnesota (IACUC) y se realizan de acuerdo con las pautas de IACUC.

1. Configuración inicial única del aparato de trasplante (Figura 1)

1. Ensamble el microscopio para trasplantes según las instrucciones del fabricante.
   NOTA: Este protocolo utiliza un microscopio de fluorescencia vertical con un objetivo de inmersión en agua de 40x.
2. Ensambl....

Discusión

Durante más de un siglo, la biología del desarrollo y la regeneración se ha basado en experimentos de trasplante para examinar los principios de la señalización celular y la determinación del destino celular. El modelo del pez cebra ya representa una poderosa fusión de enfoques genéticos y de trasplante. El trasplante en las etapas de blástula y gástrula para generar animales en mosaico es común, pero limitado en cuanto a los tipos de preguntas que puede abordar. El trasplante.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010