배아 및 유충 제브라피시에서의 고분해능 세포 이식

요약

여기에서 우리는 수정 후 최소 1일에서 7일 사이의 모든 단계에서 제브라피시 배아와 유충에서 높은 공간적 및 시간적 해상도로 세포를 이식하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

발달과 재생은 유전적으로 인코딩된 시공간적으로 역동적인 세포 상호 작용 과정에 의해 발생합니다. 세포 운명을 추적하고 기증 세포와 숙주 세포의 유전적, 공간적 또는 시간적 특성의 불일치를 유도하기 위해 동물 간 세포 이식을 사용하는 것은 이러한 상호 작용의 특성을 검사하는 강력한 수단입니다. 병아리 및 양서류와 같은 유기체는 각각 발달과 재생에 대한 우리의 이해에 결정적인 기여를 했는데, 이는 대부분 이식에 대한 그들의 친화성 때문입니다. 그러나 이러한 모델의 힘은 낮은 유전적 다루기 가능성으로 인해 제한되어 왔습니다. 마찬가지로, 주요 유전자 모델 유기체는 이식에 대한 적응성이 낮습니다.

제브라피쉬는 발달 및 재생을 위한 주요 유전자 모델이며, 세포 이식은 제브라피시에서 일반적이지만 일반적으로 초기 배반구 및 위틀라 발달 단계에서 미분화 세포의 이동으로 제한됩니다. 이 기사에서는 수정 후 최소 1일에서 7일 사이에 제브라피시 이식 기간을 모든 배아 또는 유충 단계로 확장하는 간단하고 강력한 방법을 제시합니다. 이 접근법의 정밀도는 기증자와 숙주 동물 모두에서 거의 완벽한 공간 및 시간 해상도로 하나의 세포를 이식할 수 있도록 합니다. 여기에서는 신경 발달 및 재생 연구를 위한 배아 및 유충 뉴런의 이식을 각각 강조하지만, 이 접근 방식은 광범위한 전구 세포 및 분화된 세포 유형 및 연구 질문에 적용할 수 있습니다.

서문

세포 이식은 발달 생물학의 기본 기술로서 길고 유명한 역사를 가지고 있습니다. 20^세기로 접어들면서 이식을 포함한 발달 과정을 교란하기 위해 물리적 조작을 사용하는 접근 방식은 발생학을 관찰 과학에서 실험 과학으로 변형시켰습니다 ^1,2. 한 가지 획기적인 실험에서, 한스 슈페만(Hans Spemann)과 힐데 망골트(Hilde Mangold)는 도롱뇽 배아의 등쪽 배반포자(dorsal blastopore lip)를 숙주 배아의 반대쪽에 자궁 이식하여 주변 조직이 2차 신체 축(secondary body axis)을 형성하도록 유도했다³. 이 실험은 세포가 다른 세포가 특정 운명을 채택하도록 유도할 수 있음을 보여주었고, 그 후 이식은 능력 및 세포 운명 결정, 세포 계통, 귀납 능력, 가소성 및 줄기 세포 효능에 관한 발달 생물학의 중요한 질문을 심문하는 강력한 방법으로 개발되었습니다 ^1,4,5.

프로토콜

살아있는 제브라피시와 관련된 이 절차의 모든 측면은 미네소타 대학교 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 IACUC 지침에 따라 수행됩니다.

1. 이식 장치의 일회성 초기 설정(그림 1)

1. 제조업체의 지침에 따라 이식 현미경을 조립합니다.
   참고: 이 프로토콜은 40x Water Dipping Objective가 있는 정립 형광 현미경을 사용합니다.
2. 거칠고 미세한 미세 조작기를 조립하고 제조업체의 지침에 따라 현미경 오른쪽에 장착합니다.
   참고: 스테이지가 바늘에 대해 Z 차원에서 움직이지 않는 것이 중요하기 때문에 현미경 베이스에 장착된 마이크로 매니퓰레이터가 있는 고정 스테이지 현미경을 사용합니다. 고정 스테이지 현미경을 사용할 수 없는 경우 마이크로 매니퓰레이터를 스테이지에 장착할 수 있습니다.
3. 미세전극 홀더를 전극 손잡이에 부착하고 미세조작기에 장착합니다.
4. 3방향 스톱콕의 한쪽을 마이크로 주사기 펌프에 연결합니다. 크....

토론

발달 및 재생 생물학은 100년 이상 세포 신호 전달과 세포 운명 결정의 원리를 조사하기 위해 이식 실험에 의존해 왔습니다. 제브라피시 모델은 이미 유전적 접근법과 이식 접근법의 강력한 융합을 대표하고 있습니다. 모자이크 동물을 생성하기 위해 배반포 및 위부 단계에서 이식하는 것은 일반적이지만 해결할 수 있는 질문 유형에는 제한이 있습니다. 배아 척추 운동 뉴.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010