Embriyonik ve Larva Zebra Balıklarında Yüksek Çözünürlüklü Hücre Nakli

Özet

Burada, zebra balığı embriyolarında ve larvalarında döllenmeden en az 1 ila 7 gün sonra herhangi bir aşamada yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip hücrelerin nakli için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Gelişim ve yenilenme, genetik olarak kodlanmış, uzaysal-zamansal olarak dinamik hücresel etkileşimler süreciyle gerçekleşir. Hücre kaderini izlemek ve donör ve konakçı hücrelerin genetik, mekansal veya zamansal özelliklerinde uyumsuzlukları indüklemek için hayvanlar arasında hücre naklinin kullanılması, bu etkileşimlerin doğasını incelemenin güçlü bir yoludur. Civciv ve amfibiler gibi organizmalar, büyük ölçüde transplantasyona uygunlukları nedeniyle, sırasıyla gelişim ve rejenerasyon anlayışımıza çok önemli katkılarda bulunmuştur. Bununla birlikte, bu modellerin gücü, düşük genetik izlenebilirlik ile sınırlandırılmıştır. Benzer şekilde, ana genetik model organizmaların transplantasyon için daha düşük uygunluğu vardır.

Zebra balığı, gelişim ve rejenerasyon için önemli bir genetik modeldir ve hücre nakli zebra balıklarında yaygın olsa da, genellikle gelişimin erken blastula ve gastrula aşamalarında farklılaşmamış hücrelerin transferi ile sınırlıdır. Bu yazıda, zebra balığı nakli penceresini döllenmeden en az 1 ila 7 gün sonra herhangi bir embriyonik veya larva aşamasına genişleten basit ve sağlam bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşımın hassasiyeti, hem donör hem de konakçı hayvanlarda mükemmele yakın uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip bir hücre kadar küçük bir hücrenin transplantasyonuna izin verir. Burada, sırasıyla sinir gelişimi ve rejenerasyonu çalışmaları için embriyonik ve larva nöronlarının transplantasyonunu vurgulasak da, bu yaklaşım çok çeşitli progenitör ve farklılaşmış hücre tiplerine ve araştırma sorularına uygulanabilir.

Giriş

Hücre nakli, gelişim biyolojisinde temel bir teknik olarak uzun ve köklü bir geçmişe sahiptir. 20^{. yüzyılın} başlarında, transplantasyon da dahil olmak üzere gelişim sürecini bozmak için fiziksel manipülasyonlar kullanan yaklaşımlar, embriyolojiyi gözlemsel bir bilimden deneysel bir bilime dönüştürdü ^1,2. Dönüm noktası niteliğindeki bir deneyde, Hans Spemann ve Hilde Mangold, bir semender embriyosunun dorsal blastopore dudağını ektopik olarak bir konakçı embriyonun karşı tarafına nakletti ve yakındaki dokuyu ikincil bir vücut ekseni³ oluşturmaya teşvik etti. Bu deney, hücrelerin diğer hücreleri belirli kaderleri benimsemeye teşvik edebileceğini gösterdi ve daha sonra transplantasyon, gelişim biyolojisinde yeterlilik ve hücre kaderi belirleme, hücre soyu, indüktif yetenek, plastisite ve kök hücre gücü ile ilgili kritik soruları sorgulamak için güçlü bir yöntem olarak geliştirildi ^1,4,5.

Daha yeni bilimsel gelişmeler, transplantasyon yaklaşımının gücünü genişletmiştir. 1969'da Nicole Le Douarin'in nükleolar boyamanın bıldırcın-civciv kimeralarındaki köken türlerini ayırt edebileceğini keşfetmesi, nakledilen hücrelerin ve soylarının izlenmesine izin verdi⁶. Bu kavram daha sonra transgenik floresan belirteçlerin ve gelişmiş görüntüleme tekniklerinin⁵ ortaya çıkmasıyla güçlendirildi ve hücre kaderini ^6,7 izlemek, kök hücreleri ve güçlerini ^8,9 tanımlamak ve beyin gelişimi sırasında hücre hareketlerini izlemek^{için kullanıldı 10}. Ek olarak, moleküler genetiğin yükselişi, gelişimsel faktörlerin özerk ve özerk olmayan işlevlerinin kesin diseksiyonunu destekleyerek, farklı genotiplerin konakçıları ve donörleri arasındaki transplantasyonu kolaylaştırdı¹¹.

Transplantasyon ayrıca, rejenerasyon dokularının büyümesini ve şekillenmesini düzenleyen hücresel kimlikleri ve etkileşimleri açıklayarak, özellikle planaryalar ve aksolotl gibi güçlü rejeneratif yeteneklere sahip organizmalarda rejenerasyon çalışmalarına önemli katkılarda bulunmuştur. Nakil çalışmaları, potens¹², mekansal modelleme^13,14, spesifik dokuların^{katkıları 15,16} ve rejenerasyonda hücresel hafıza^{için roller 12,17} ilkelerini ortaya koymuştur.

Zebra balığı, korunmuş genetik programları, yüksek genetik izlenebilirliği, dış döllenmesi, büyük kavrama boyutu ve optik netliği nedeniyle sinir sistemi de dahil olmak üzere gelişim ve yenilenme çalışmaları için önde gelen bir omurgalı modelidir 18,19,20. Zebra balığı ayrıca erken gelişim aşamalarında transplantasyona oldukça uygundur. En belirgin yaklaşım, mozaik hayvanlar oluşturmak için etiketli bir donör embriyodan hücrelerin blastula veya gastrula aşamasında bir konakçı embriyoya nakledilmesidir. Blastula aşaması sırasında nakledilen hücreler, epiboli başladığında dağılacak ve dağılacak ve embriyo²¹ boyunca etiketli hücreler ve dokulardan oluşan bir mozaik üretecektir. Gastrula nakilleri, kalkan oluştuğu ve A-P ve D-V eksenleri belirlenebildiği için nakledilen hücrelerin kaba bir kader haritasına göre bir miktar hedeflenmesine izin verir²¹. Elde edilen mozaikler, genlerin hücreye özerk bir şekilde hareket edip etmediğini belirlemede, hücre bağlılığını test etmede ve gelişim boyunca doku hareketini ve hücre göçünü haritalamada^{değerli olmuştur 5,11}. Mozaik zebra balığı, elektroporasyon²², rekombinasyon²³ ve F0 transgenezi²⁴ ve mutajenez²⁵ dahil olmak üzere çeşitli şekillerde üretilebilir, ancak transplantasyon, uzay, zaman, hücre sayısı ve türlerinde en büyük manipüle edilebilirliği ve hassasiyeti sağlar. Zebra balığı transplantasyonunun mevcut durumu, spinal motor nöronların ^26,27, retinal ganglion hücrelerinin ^28,29 ve döllenmeden sonraki ilk 10-30 saat içinde nöral krest hücrelerinin transplantasyonu (hpf)30 ve yetişkin zebra balıklarında hematopoietik ve tümör hücrelerinin^{nakli dahil} olmak üzere birkaç istisna dışında, erken aşamalarda progenitör hücrelerle büyük ölçüde sınırlıdır (hpf)³⁰ ve yetişkin zebra balıklarında hematopoietik ve tümör hücrelerinin ^5,31. Transplantasyon yöntemlerini geniş bir yaş aralığına, farklılaşma aşamalarına ve hücre tiplerine genişletmek, bu yaklaşımın gelişimsel ve rejeneratif süreçler hakkında bilgi sağlama gücünü büyük ölçüde artıracaktır.

Burada, zebra balığı embriyolarında ve larvalarında döllenmeden en az 7 gün sonrasına kadar etkili olan yüksek çözünürlüklü hücre nakli için esnek ve sağlam bir teknik gösteriyoruz. Hedef dokularda floresan proteinleri eksprese eden transgenik konakçı ve donör balıklar, tek hücreleri çıkarmak ve bunları mükemmele yakın uzamsal ve zamansal çözünürlükle nakletmek için kullanılabilir. Zebra balığı embriyolarının ve larvalarının optik berraklığı, nakledilen hücrelerin, konakçı hayvan gelişirken veya yenilenirken canlı olarak görüntülenmesine olanak tanır. Bu yaklaşım daha önce uzay-zamansal sinyal dinamiklerinin embriyo^32'de nöronal kimliği ve akson rehberliğini nasıl etkilediğini incelemek ve larva balıklarında³³ rejenerasyon sırasında içsel ve dışsal faktörlerin akson rehberliğini teşvik ettiği mantığı incelemek için kullanılmıştır. Burada farklılaşmış nöronların transplantasyonuna odaklanırken, yöntemimiz gelişim ve rejenerasyondaki soruları ele almak için birçok aşamada ve dokuda hem farklılaşmamış hem de farklılaşmış hücre tiplerine yaygın olarak uygulanabilir.

Protokol

Bu prosedürün canlı zebra balığı ile çalışmakla ilgili tüm yönleri Minnesota Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve IACUC yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmektedir.

1. Nakil aparatının tek seferlik ilk kurulumu (Şekil 1)

1. Nakil mikroskobunu üreticinin talimatlarına göre monte edin.
   NOT: Bu protokol, 40x su daldırma objektifine sahip dik bir floresan mikroskobu kullanır.
2. Kaba ve ince mikromanipülatörleri birleştirin ve üreticinin talimatlarına göre mikroskobun sağ tarafına monte edin.
   NOT: Sahnenin iğneye göre Z boyutunda hareket etmemesi önemli olduğundan, mikroskop tabanına monte edilmiş mikromanipülatörler ile sabit kademeli bir mikroskop kullanıyoruz. Sabit kademeli bir mikroskop mevcut değilse, mikromanipülatör sahneye monte edilebilir.
3. Mikroelektrot tutucuyu elektrot tutamağına takın ve mikromanipülatöre monte edin.
4. Üç musluğun bir tarafını mikroşırınga pompasına bağlayın. Vananın diğer tarafını kromatografi adaptörünü kullanarak polietilen boruya bağlayın.
5. Polietilen borunun karşı tarafını kromatografi adaptörünü kullanarak mikroelektrot tutucusuna bağlayın.
6. 10 mL'lik rezervuar şırıngasını hafif mineral yağ ile doldurun ve musluğun üst tarafına monte edin.
7. Mikroşırınga pompasını ve hortumunu (hidrolik hat) rezervuardan mineral yağ ile doldurun ve tüm hava kabarcıklarını çıkardığınızdan emin olun.
   NOT: Cihaz kurulduktan sonra, hidrolik hattın yalnızca ara sıra bakımını gerektirecektir. Rezervuar şırıngası çıkarılabilir ve gerektiğinde mineral yağ ile yeniden doldurulabilir.

2. Embriyo iticileri hazırlayın.

1. 2 cm'lik bir misina parçası kesin ve ~1,5 cm açıkta kalacak şekilde kısmen P1000 pipet ucunun dar ucuna sokun. Oltayı küçük bir damla süper yapıştırıcı ile sabitleyin ve kurumaya bırakın.

3. Çözümler hazırlayın.

1. Embriyo ortamında (LMA) çözülen %1 düşük erime noktalı agarozu hazırlamak için, agarozu kaynayan embriyo ortamında^{çözün 34}. Yuvarlak tabanlı test tüplerinde 1-2 mL alikotlar yapın ve 4 ° C'de saklayın.
2. Aşağıdaki bileşenleri 116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2, 50 birim / mL penisilin ve 50ug / mL streptomisin nihai konsantrasyonlarına birleştirerek Ringer'in penisilin-streptomisin ve trikat (RPT) ile çözeltisini hazırlayın, eriyene kadar karıştırın ve bir vakum filtresinden geçirin. Oda sıcaklığında saklayın. Kullanmadan hemen önce% 0.02'lik bir konsantrasyona tricaine ekleyin.

4. Donör ve ev sahibi hayvanları nakil için hazırlayın.

1. Uygun genotiplere sahip konakçı ve donör hayvanları ve floresan olarak etiketlenmiş ilgili hücrelerle istenen yaşa yükseltin.
   NOT: Bu nakiller için Tg(isl1:EGFPCAAX)^fh474 donör hayvanlar³² ve Tg(isl1:mRFP)^fh1 konakçı hayvanlar³⁵ kullandık ve donörden konakçı vagus motor çekirdeklerine 3dpf'de nöronlar nakledildi.
2. Her cam slayta dikdörtgen bir şeffaf oje taslağı uygulayarak nakil slaytları hazırlayın (Şekil 2A). Oje, adım 4.8'de eklenen RPT'yi tutmak için hidrofobik bir bariyer oluşturur. Kullanmadan önce tamamen kurumasını bekleyin.
   NOT: Slaytlar önceden hazırlanabilir ve süresiz olarak saklanabilir.
3. 40 mL su içeren 50 mL'lik bir behere bir tüp LMA yerleştirerek ve 1 dakika boyunca% 50 güçte veya eriyene kadar mikrodalgada pişirerek bir LMA alikotunu eritin. LMA'yı kuru banyo ısıtıcısında 40 °C'de tutun.
4. Ev sahibi ve donör hayvanları forseps ile (varsa) dekoryonlayın ve oda sıcaklığında RPT ile doldurulmuş küçük Petri kaplarına yerleştirerek uyuşturun. Devam etmeden önce hayvanların tamamen anestezi alması için 5 dakika bekleyin.
5. Bireysel donör ve ev sahibi hayvanları monte edin: Pasteur pipet ve pipet pompasını kullanarak, hayvanları RPT'den LMA'ya aktarın, ardından hayvanları küçük LMA damlaları halinde oje taslağı içindeki slaytlara aktarın. LMA'nın seyreltilmemesi için LMA'ya aktarılan RPT miktarını en aza indirin. LMA katılaşmadan önce, hayvanları yönlendirmek için bir embriyo itici kullanın, her bir hayvanın amaçlanan iğne yerleştirme yeri sağa doğru monte edildiğinden ve tüm hayvanların dikey olarak hizalandığından emin olun (Şekil 2B); Devam etmeden önce agarozun tamamen kurumasına (~ 5 dakika) izin verin.
   NOT: Her donör hayvandan çok sayıda hücre alınabileceğinden, her slayta bir donör ile 2-4 konakçı hayvanı monte etmek daha verimlidir.
6. Bir neşter kullanarak, monte edilmiş hayvanların hemen sağındaki tüm agaroz damlalarından düz bir dikey dilim kesin (Şekil 2C). Gevşek agarozu laboratuvar mendilleriyle slayttan çıkarın.
7. Bir neşter kullanarak, iğne yerleştirme bölgesini ortaya çıkarmak için agarozdan takozlar kesin (Şekil 2C). Gevşek agarozu laboratuvar mendilleriyle slayttan çıkarın.
8. Agaroz damlaları tamamen suya batırana kadar slayta RPT uygulayın (Şekil 2D).
9. Hazırlanan slaytı transplantasyon mikroskobuna monte edin. Donör hayvanı 40x hedefi kapsamında odak noktasına getirin. Bunu yapmak için, hedefi ortamın yüzeyini kırana kadar indirin, ardından hedefi istenen odak düzlemine yükseltin.
   NOT: Nakil tamamlanana kadar objektif ile sıvı teması sürdürülmelidir (Şekil 3C).
10. İlgilendiğiniz floresan etiketli donör hücre(ler)i odak noktasına getirin; Ardından, nakil iğnesini bulmak için hazırlık olarak sahneyi sola hareket ettirin.
    NOT: Bu noktada, 5. bölümde donör hayvanı kolayca yeniden bulabilmeniz için mikroskobu Y veya Z eksenlerinde ayarlamayın.

5. Nakil iğnesini hazırlayın.

1. Mikropipet çekiciye bir mikropipet yerleştirin ve bir mikroenjeksiyon iğnesi çekin.
   NOT: İğnenin şekli, 1 hücreli aşamalı zebra balığı embriyo enjeksiyonları veya yama klempleme için kullanılanlara benzer olmalıdır. Aşağıdaki programa sahip bir mikropipet çektirme kullanıyoruz: BASINÇ = 500, ISI = rampa + 80, ÇEKME = 90, HIZ = 70, ZAMAN = 250 (Malzeme Tablosuna bakın), ancak her bir çektirme için doğru ayarların muhtemelen ampirik olarak belirlenmesi gerekecektir.
2. İğne ucunu, bir diseksiyon kapsamı altında sahne mikrometresinin bölümleriyle hizalayın. Mikrometreyi bir ölçüm kılavuzu olarak kullanarak, iğneyi ilgilenilen hücrelerin çapından biraz daha büyük bir delik boyutuna kırmak için keskinleştirilmiş bir forseps çifti kullanın (Şekil 3A). Pürüzlü kenarlar iğnenin tıkanmasına katkıda bulunabileceğinden, kırılmanın mümkün olduğunca temiz olduğundan emin olun. NOT: Vagus motor nöronlar (5-7 μm çapında) için iğneler, 20 μm'lik bir dış çapa karşılık gelen 10 μm'lik bir iç çapa kadar kırılmalıdır. Gerekirse, iğne ucunun boyutu, şekli ve/veya açısı bir microforge veya microgrinder³⁶ ile iyileştirilebilir.
3. Hafif mineral yağ ile doldurulmuş ve pipet dolgusu ile donatılmış 50 mL'lik bir şırınga kullanarak iğneyi tamamen mineral yağ ile doldurun (Şekil 3B). Hava kabarcığı olmadığından emin olun. Doldurulmuş iğneyi montaj için hazır olana kadar bir kenara koyun.
   NOT: Hava kabarcığı olmadığından emin olmak için, pipet dolgusunu iğnenin içine sonuna kadar sokun ve dolguyu iğneden yavaşça çekerken yağı serbest bırakın.
4. Nakil aparatında, üç musluğu, uzun kolu mikroşırınga pompasına bakacak şekilde çevirin ve hidrolik hattaki tüm hava kabarcıklarını temizlemek için rezervuar şırınga pistonuna basın. Piston üzerinde hafif bir basınç uygulayın (havanın hatta geri akışını önlemek için) ve üç vanayı uzun kolu rezervuar şırıngasına bakacak şekilde çevirin.
5. Herhangi bir hava kabarcığı girmemesine dikkat ederek iğneyi tutucuya yerleştirin. İğnenin açısını, yataydan 10-15°'lik bir açıyla doğrudan sola bakacak şekilde ayarlayın (Şekil 3C).
6. İğnenin ucunu mikroskop objektifi altında hareket ettirmek ve odak noktasına getirmek için kaba ve ince mikromanipülatörleri kullanın (Şekil 3D).
   NOT: İğnenin X ve Y düzlemlerinde kaba konumlandırılması, iğneyi hareket ettirirken hedefin altındaki alanı doğrudan gözlemleyerek yapılabilir, çünkü iğne objektifin altına yerleştirildiğinde iletilen ışık huzmesini yansıtacaktır. Mikroskop göz mercekleri daha sonra ince konumlandırma için kullanılabilir. Bu adım sırasında mikroskop tablasının konumunu veya odağını ayarlamayın. İğne ucunu mevcut odak konumuna getirmek için mikromanipülatörleri kullanın.
7. İğne ucunun içine veya dışına sıvı akıyorsa, mineral yağ ile Ringer solüsyonu arasında stabil bir menisküs gözlenene kadar şırınga pompasını kullanarak basıncı ayarlayın (Şekil 3D).
   NOT: Stabilizasyondan sonra iğne ucunda bir yağ kabarcığı kalırsa, iğneyi ucu RPT'den çekilene kadar sağa, ardından tekrar sola hareket ettirmek için kaba mikromanipülatör üzerindeki X düzlemi ayarı kullanılarak çıkarılabilir.

6. Transplantasyon

NOT: Tüm iğne hareketleri bu bölüm için ince mikromanipülatör kullanılarak yapılmalıdır.

1. Donör hayvan tekrar görüş alanına getirilene kadar sahneyi sağa hareket ettirin ve iğnenin yanlışlıkla girmesini önlemek için dikkatli olun.
2. Nakledilecek hücreleri yeniden merkezleyin ve odaklanın ve iğneyi hayvanın hemen dışındaki hücrelerle hizalayın (Şekil 4A).
   NOT: Doğru hizalamayı sağlamak için parlak alan ve floresan arasında sık sık geçiş yapmanız gerekebilir. Nötr yoğunluk filtresinin kullanılması, her ikisini de aynı anda görselleştirmeye yardımcı olabilir.
3. İğneyi donör hayvana yerleştirin.
   NOT: İğne ile tekrarlanan içeri ve dışarı hareketler cilde nüfuz etmeye yardımcı olabilir.
4. İğne ucundaki yağ menisküsünü adım 5.7'de açıklandığı gibi mikroşırga pompası ile hemen yeniden stabilize edin.
5. İğne ucunu ilgilenilen hücrelere karşı konumlandırın ve mikroşırınga pompası ile hafif emme uygulayın (Şekil 4B).
   NOT: Emme sırasında hafif içeri ve dışarı hareketler hücrelerin gevşemesine yardımcı olabilir.
6. Yeterli sayıda hücre alındığında, iğneyi donörden çıkarın ve iğne ucundaki yağ menisküsünü mikroşırga pompası ile hemen yeniden stabilize edin.
7. İğne ile hayvanlara veya agaroza temas etmekten kaçınmaya dikkat ederek, ilk ev sahibi hayvanı görünecek şekilde sahneyi yeniden konumlandırın.
8. Hücrelerin yerleştirileceği alanı ortalayın ve odaklanın ve iğneyi hayvanın hemen dışındaki bu bölge ile hizalayın (Şekil 4C).
9. İğneyi konakçı hayvana yerleştirin ve iğne ucundaki yağ menisküsünü mikroşırınga pompası ile hemen yeniden stabilize edin.
10. İğne ucunu biriktirme bölgesine yerleştirin ve iğneden doğru sayıda donör hücre salınana kadar mikroşırınga pompası ile hafif bir basınç uygulayın (Şekil 4D).
    NOT: Donör ve konakçı hücreler farklı floroforlarla etiketlenmişse, eşzamanlı görselleştirmeye izin veren çok bantlı bir filtre bu aşamada çok yardımcı olabilir.
11. İğneyi konakçıdan çıkarın ve iğne ucundaki yağ menisküsünü mikroşırınga pompası ile hemen yeniden stabilize edin.
12. Kalan tüm ana bilgisayarlar için 6.7-6.11 adımlarını tekrarlayın.

7. Ev sahibi hayvanın geri kazanılması

1. 40x objektifi kaldırın ve iğneyi yükleme konumuna geri döndürmek için kaba mikromanipülatörü kullanın.
   NOT: İğne birden fazla slayt için yeniden kullanılabilir.
2. Slaytı nakil mikroskobundan çıkarın ve diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.
3. Ev sahibi hayvanları forseps ile LMA düşüşünden dikkatlice çıkararak çıkarın. Bir cam Pasteur pipeti kullanarak, ev sahibi hayvanları penisilin / streptomisin içeren taze Ringer solüsyonu içeren bir tabağa aktarın. Hayvanların anesteziden kurtulduğundan emin olun ve görüntülenmeye hazır olana kadar onları bir embriyo kuluçka makinesinde tutun. Donör hayvanları onaylanmış protokollere göre ötenazi yapın.
   NOT: Ötenazi için yöntemimiz, hayvanları en az 1 saat buz banyosuna batırmak ve ardından 500 mg / L sodyum hipoklorit içine daldırmaktır.

Sonuçlar

Transplantasyon deneylerinin sonuçları, bir floresan mikroskobu kullanılarak transplantasyon sonrası uygun zaman noktalarında konakçı hayvanlarda floresan etiketli donör hücrelerin görselleştirilmesiyle doğrudan gözlemlenir. Burada, 3 dpf'de bireysel anterior vagus nöronlarını naklettik. Ev sahibi hayvanlar daha sonra 12 veya 48 saat inkübe edildi, anestezi uygulandı, LMA'ya bir cam lamel üzerine monte edildi ve konfokal mikroskop ile görüntülendi (

Tartışmalar

Gelişimsel ve rejeneratif biyoloji, bir asırdan fazla bir süredir, hücre sinyalizasyonu ve hücre kaderi belirleme ilkelerini incelemek için transplantasyon deneylerine güvenmiştir. Zebra balığı modeli zaten genetik ve transplantasyon yaklaşımlarının güçlü bir birleşimini temsil ediyor. Mozaik hayvanlar oluşturmak için blastula ve gastrula aşamalarında transplantasyon yaygındır, ancak ne tür soruları ele alabileceği konusunda sınırlıdır. Embriyonik spinal m...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010