Embriyonik ve Larva Zebra Balıklarında Yüksek Çözünürlüklü Hücre Nakli

Özet

Burada, zebra balığı embriyolarında ve larvalarında döllenmeden en az 1 ila 7 gün sonra herhangi bir aşamada yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip hücrelerin nakli için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Gelişim ve yenilenme, genetik olarak kodlanmış, uzaysal-zamansal olarak dinamik hücresel etkileşimler süreciyle gerçekleşir. Hücre kaderini izlemek ve donör ve konakçı hücrelerin genetik, mekansal veya zamansal özelliklerinde uyumsuzlukları indüklemek için hayvanlar arasında hücre naklinin kullanılması, bu etkileşimlerin doğasını incelemenin güçlü bir yoludur. Civciv ve amfibiler gibi organizmalar, büyük ölçüde transplantasyona uygunlukları nedeniyle, sırasıyla gelişim ve rejenerasyon anlayışımıza çok önemli katkılarda bulunmuştur. Bununla birlikte, bu modellerin gücü, düşük genetik izlenebilirlik ile sınırlandırılmıştır. Benzer şekilde, ana genetik model organizmaların transplantasyon için daha düşük uygunluğu vardır.

Zebra balığı, gelişim ve rejenerasyon için önemli bir genetik modeldir ve hücre nakli zebra balıklarında yaygın olsa da, genellikle gelişimin erken blastula ve gastrula aşamalarında farklılaşmamış hücrelerin transferi ile sınırlıdır. Bu yazıda, zebra balığı nakli penceresini döllenmeden en az 1 ila 7 gün sonra herhangi bir embriyonik veya larva aşamasına genişleten basit ve sağlam bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşımın hassasiyeti, hem donör hem de konakçı hayvanlarda mükemmele yakın uzamsal ve zamansal çözünürlüğe sahip bir hücre kadar küçük bir hücrenin transplantasyonuna izin verir. Burada, sırasıyla sinir gelişimi ve rejenerasyonu çalışmaları için embriyonik ve larva nöronlarının transplantasyonunu vurgulasak da, bu yaklaşım çok çeşitli progenitör ve farklılaşmış hücre tiplerine ve araştırma sorularına uygulanabilir.

Giriş

Hücre nakli, gelişim biyolojisinde temel bir teknik olarak uzun ve köklü bir geçmişe sahiptir. 20^{. yüzyılın} başlarında, transplantasyon da dahil olmak üzere gelişim sürecini bozmak için fiziksel manipülasyonlar kullanan yaklaşımlar, embriyolojiyi gözlemsel bir bilimden deneysel bir bilime dönüştürdü ^1,2. Dönüm noktası niteliğindeki bir deneyde, Hans Spemann ve Hilde Mangold, bir semender embriyosunun dorsal blastopore dudağını ektopik olarak bir konakçı embriyonun karşı tarafına nakletti ve yakındaki dokuyu ikincil bir vücut ekseni³ oluşturma....

Protokol

Bu prosedürün canlı zebra balığı ile çalışmakla ilgili tüm yönleri Minnesota Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve IACUC yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmektedir.

1. Nakil aparatının tek seferlik ilk kurulumu (Şekil 1)

1. Nakil mikroskobunu üreticinin talimatlarına göre monte edin.
   NOT: Bu protokol, 40x su daldırma objektifine sahip dik bir floresan mikroskobu kullanır.
2. Kaba ve ince mikromanipülatörleri birleştirin ve üreticinin talimatlarına göre mikroskobun s....

Tartışmalar

Gelişimsel ve rejeneratif biyoloji, bir asırdan fazla bir süredir, hücre sinyalizasyonu ve hücre kaderi belirleme ilkelerini incelemek için transplantasyon deneylerine güvenmiştir. Zebra balığı modeli zaten genetik ve transplantasyon yaklaşımlarının güçlü bir birleşimini temsil ediyor. Mozaik hayvanlar oluşturmak için blastula ve gastrula aşamalarında transplantasyon yaygındır, ancak ne tür soruları ele alabileceği konusunda sınırlıdır. Embriyonik spinal m.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010