Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Transplantation von Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in Zebrafischembryonen und -larven in jedem Stadium zwischen mindestens 1 und 7 Tagen nach der Befruchtung vor.

Zusammenfassung

Entwicklung und Regeneration erfolgen durch einen Prozess genetisch kodierter raumzeitlich dynamischer zellulärer Interaktionen. Der Einsatz von Zelltransplantationen zwischen Tieren, um das Zellschicksal zu verfolgen und Diskrepanzen in den genetischen, räumlichen oder zeitlichen Eigenschaften von Spender- und Wirtszellen zu induzieren, ist ein wirksames Mittel, um die Art dieser Wechselwirkungen zu untersuchen. Organismen wie Küken und Amphibien haben entscheidende Beiträge zu unserem Verständnis von Entwicklung bzw. Regeneration geleistet, vor allem aufgrund ihrer Eignung für Transplantationen. Die Leistungsfähigkeit dieser Modelle wurde jedoch durch die geringe genetische Rückverfolgbarkeit begrenzt. Ebenso sind die wichtigsten genetischen Modellorganismen weniger anfällig für Transplantationen.

Der Zebrafisch ist ein wichtiges genetisches Modell für Entwicklung und Regeneration, und während Zelltransplantationen bei Zebrafischen üblich sind, beschränken sie sich im Allgemeinen auf den Transfer undifferenzierter Zellen in den frühen Entwicklungsstadien der Blastula und Gastrula. In diesem Artikel stellen wir eine einfache und robuste Methode vor, die das Zeitfenster für eine Zebrafischtransplantation auf jedes Embryonal- oder Larvenstadium zwischen mindestens 1 und 7 Tagen nach der Befruchtung erweitert. Die Präzision dieses Ansatzes ermöglicht die Transplantation von nur einer Zelle mit nahezu perfekter räumlicher und zeitlicher Auflösung sowohl bei Spender- als auch bei Wirtstieren. Während wir hier die Transplantation von embryonalen und larvalen Neuronen zur Untersuchung der Nervenentwicklung bzw. -regeneration hervorheben, ist dieser Ansatz auf ein breites Spektrum von Vorläufer- und differenzierten Zelltypen und Forschungsfragen anwendbar.

Einleitung

Die Zelltransplantation hat eine lange und geschichtsträchtige Geschichte als grundlegende Technik in der Entwicklungsbiologie. Um die Wende zum 20^{. Jahrhundert verwandelten} Ansätze, die physikalische Manipulationen zur Störung des Entwicklungsprozesses, einschließlich der Transplantation, nutzten, um die Embryologie von einer beobachtenden Wissenschaft in eine experimentelle Wissenschaft ^1,2. In einem bahnbrechenden Experiment transplantierten Hans Spemann und Hilde Mangold ektopisch die dorsale blastopore Lippe eines Salamanderembryos auf die gegenüberliegende Seite eines Wirtsembryos, wodurch das nahe gelegene Gewebe dazu gebracht wurde, eine sekundäre Körperachse³ zu bilden. Dieses Experiment zeigte, dass Zellen andere Zellen dazu bringen können, bestimmte Schicksale anzunehmen, und in der Folge entwickelte sich die Transplantation als leistungsfähige Methode, um kritische Fragen in der Entwicklungsbiologie in Bezug auf Kompetenz und Zellschicksalsbestimmung, Zellabstammung, induktive Fähigkeit, Plastizität und Stammzellpotenz zu hinterfragen ^1,4,5.

Neuere wissenschaftliche Fortschritte haben die Leistungsfähigkeit des Transplantationsansatzes erweitert. Im Jahr 1969 ermöglichte Nicole Le Douarins Entdeckung, dass die nukleoläre Färbung Ursprungsarten in Wachtel-Küken-Chimären unterscheiden kann, die Verfolgung transplantierter Zellen und ihrer Nachkommen⁶. Dieses Konzept wurde später durch das Aufkommen transgener Fluoreszenzmarker und fortschrittlicher bildgebender Verfahren verstärkt⁵ und wurde genutzt, um das Zellschicksal zu verfolgen ^6,7, Stammzellen und ihre Potenz zu identifizieren ^8,9 und Zellbewegungen während der Gehirnentwicklung^{zu verfolgen 10}. Darüber hinaus erleichterte das Aufkommen der Molekulargenetik die Transplantation zwischen Wirten und Spendern unterschiedlicher Genotypen und unterstützte die präzise Aufschlüsselung autonomer und nicht-autonomer Funktionen von Entwicklungsfaktoren¹¹.

Die Transplantation hat auch einen wichtigen Beitrag zur Erforschung der Regeneration geleistet, insbesondere bei Organismen mit starken regenerativen Fähigkeiten wie Planarien und Axolotln, indem sie die zellulären Identitäten und Wechselwirkungen aufklärte, die das Wachstum und die Musterbildung von regenerierendem Gewebe regulieren. Transplantationsstudien haben Prinzipien der Potenz¹², der räumlichen Musterbildung^13,14, der Beiträge spezifischer Gewebe^15,16 und der Rolle des zellulären Gedächtnisses^12,17 bei der Regeneration aufgedeckt.

Zebrafische sind aufgrund ihrer konservierten genetischen Programme, ihrer hohen genetischen Rückverfolgbarkeit, ihrer externen Befruchtung, ihrer großen Gelegegröße und ihrer optischen Klarheit ein führendes Wirbeltiermodell für die Erforschung von Entwicklung und Regeneration, einschließlich des Nervensystems. Zebrafische sind auch sehr gut für eine Transplantation in frühen Entwicklungsstadien geeignet. Der bekannteste Ansatz ist die Transplantation von Zellen von einem markierten Spenderembryo auf einen Wirtsembryo im Blastula- oder Gastrula-Stadium, um Mosaiktiere zu erzeugen. Zellen, die während des Blastula-Stadiums transplantiert werden, zerstreuen und zerstreuen sich, wenn die Epibolie beginnt, wodurch ein Mosaik aus markierten Zellen und Geweben über den Embryo entsteht²¹. Gastroula-Transplantationen ermöglichen ein gewisses Targeting von transplantierten Zellen gemäß einer groben Schicksalskarte, da die Schildformen und die A-P- und D-V-Achsen bestimmt werden können²¹. Die daraus resultierenden Mosaike waren wertvoll bei der Bestimmung, ob Gene zellautonom handeln, bei der Untersuchung des Zellengagements und bei der Kartierung von Gewebebewegungen und Zellmigration während der gesamten Entwicklung ^5,11. Mosaik-Zebrafische können auf verschiedene Weise erzeugt werden, einschließlich Elektroporation²², Rekombination²³ und F0-Transgenese²⁴ und Mutagenese²⁵, aber die Transplantation bietet die größte Manipulierbarkeit und Präzision in Bezug auf Raum, Zeit, Anzahl und Art der Zellen. Der derzeitige Stand der Zebrafischtransplantation ist weitgehend auf Vorläuferzellen in frühen Stadien beschränkt, mit wenigen Ausnahmen wie der Transplantation von spinalen Motoneuronen ^26,27, retinalen Ganglienzellen^28,29 und Neuralleistenzellen in den ersten 10-30 Stunden nach der Befruchtung (hpf)³⁰ und von hämatopoetischen und Tumorzellen bei adulten Zebrafischen ^5,31. Die Ausweitung der Transplantationsmethoden auf ein breites Spektrum von Altersgruppen, Differenzierungsstadien und Zelltypen würde die Leistungsfähigkeit dieses Ansatzes, Einblicke in Entwicklungs- und Regenerationsprozesse zu gewinnen, erheblich verbessern.

Hier demonstrieren wir eine flexible und robuste Technik für die hochauflösende Zelltransplantation, die bei Zebrafischembryonen und -larven bis zu mindestens 7 Tage nach der Befruchtung wirksam ist. Transgene Wirts- und Spenderfische, die fluoreszierende Proteine in Zielgeweben exprimieren, können verwendet werden, um einzelne Zellen zu extrahieren und sie mit nahezu perfekter räumlicher und zeitlicher Auflösung zu transplantieren. Die optische Klarheit von Zebrafischembryonen und -larven ermöglicht es, die transplantierten Zellen live abzubilden, während sich das Wirtstier entwickelt oder regeneriert. Dieser Ansatz wurde bereits verwendet, um zu untersuchen, wie die raumzeitliche Signaldynamik die neuronale Identität und die Axonführung im Embryo^{beeinflusst 32}, und um die Logik zu untersuchen, nach der intrinsische und extrinsische Faktoren die Axonführung während der Regeneration bei Fischlarven fördern³³. Während wir uns hier auf die Transplantation differenzierter Neuronen konzentrieren, ist unsere Methode sowohl auf undifferenzierte als auch auf differenzierte Zelltypen über viele Stadien und Gewebe hinweg anwendbar, um Fragen der Entwicklung und Regeneration zu beantworten.

Protokoll

Alle Aspekte dieses Verfahrens, die sich auf die Arbeit mit lebenden Zebrafischen beziehen, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Minnesota genehmigt und werden in Übereinstimmung mit den IACUC-Richtlinien durchgeführt.

1. Einmalige Ersteinrichtung des Transplantationsgeräts (Abbildung 1)

1. Montieren Sie das Transplantationsmikroskop gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   HINWEIS: Bei diesem Protokoll wird ein aufrechtes Fluoreszenzmikroskop mit einem 40-fachen Wassertauchobjektiv verwendet.
2. Montieren Sie die groben und feinen Mikromanipulatoren und montieren Sie sie auf der rechten Seite des Mikroskops nach Herstellerangaben.
   HINWEIS: Da es wichtig ist, dass sich der Tisch nicht in der Z-Dimension relativ zur Nadel bewegt, verwenden wir ein Mikroskop mit festem Tisch, bei dem die Mikromanipulatoren an der Mikroskopbasis montiert sind. Wenn kein festes Tischmikroskop zur Verfügung steht, kann der Mikromanipulator auf den Tisch montiert werden.
3. Befestigen Sie den Mikroelektrodenhalter am Elektrodengriff und montieren Sie ihn am Mikromanipulator.
4. Verbinden Sie eine Seite des Dreiwege-Absperrhahns mit der Mikrospritzenpumpe. Verbinden Sie die andere Seite des Absperrhahns mit dem Chromatographie-Adapter mit dem Polyethylenschlauch.
5. Verbinden Sie die gegenüberliegende Seite des Polyethylenschlauchs mit dem Chromatographie-Adapter mit dem Mikroelektrodenhalter.
6. Füllen Sie die 10-mL-Reservoirspritze mit leichtem Mineralöl und montieren Sie sie auf der Oberseite des Absperrhahns.
7. Füllen Sie die Pumpe und den Schlauch (die Hydraulikleitung) mit Mineralöl aus dem Behälter und achten Sie darauf, alle Luftblasen zu entfernen.
   HINWEIS: Sobald das Gerät eingerichtet ist, muss die Hydraulikleitung nur gelegentlich gewartet werden. Die Behälterspritze kann bei Bedarf entnommen und mit Mineralöl nachgefüllt werden.

2. Bereiten Sie Embryo-Pusher vor.

1. Schneiden Sie ein 2 cm langes Stück Angelschnur ab und stecken Sie es teilweise in das schmale Ende einer P1000-Pipettenspitze, so dass ~1,5 cm freiliegen. Befestigen Sie die Angelschnur mit einem kleinen Tropfen Sekundenkleber und lassen Sie sie trocknen.

3. Bereiten Sie Lösungen vor.

1. Zur Herstellung von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt von 1 %, gelöst in Embryomedien (LMA), wird Agarose in siedendem Embryomedium³⁴ gelöst. 1-2 mL Aliquots in Reagenzgläsern mit rundem Boden herstellen und bei 4 °C lagern.
2. Bereiten Sie die Ringer-Lösung mit Penicillin-Streptomycin und Tricain (RPT) vor, indem Sie die folgenden Zutaten in Endkonzentrationen von 116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7,2, 50 Einheiten/ml Penicillin und 50μg/ml Streptomycin kombinieren, rühren, bis sie aufgelöst sind, und durch einen Vakuumfilter passieren. Bei Raumtemperatur lagern. Geben Sie Tricain unmittelbar vor Gebrauch in einer Konzentration von 0,02% zu.

4. Bereiten Sie Spender- und Wirtstiere auf die Transplantation vor.

1. Wirts- und Spendertiere mit den entsprechenden Genotypen und mit fluoreszenzmarkierten Zellen von Interesse auf das gewünschte Alter aufziehen.
   HINWEIS: Für diese Transplantationen verwendeten wir Tg(isl1:EGFPCAAX)^fh474 Spendertiere³² und Tg(isl1:mRFP)^fh1 Wirtstiere³⁵ und transplantierten Neuronen von den motorischen Vaguskernen des Spenders auf den Wirt bei 3dpf.
2. Bereiten Sie Transplantatpräparate vor, indem Sie einen rechteckigen Umriss aus klarem Nagellack auf jeden Objektträger auftragen (Abbildung 2A). Der Nagellack bildet eine hydrophobe Barriere, die das in Schritt 4.8 hinzugefügte RPT hält. Vor Gebrauch vollständig trocknen lassen.
   HINWEIS: Objektträger können im Voraus vorbereitet und unbegrenzt gespeichert werden.
3. Schmelzen Sie ein LMA-Aliquot, indem Sie ein Röhrchen LMA in ein 50-ml-Becherglas mit 40 ml Wasser geben und 1 Minute lang bei 50 % Leistung in der Mikrowelle erhitzen oder bis es geschmolzen ist. Halten Sie LMA bei 40 °C in einem Trockenbadofen.
4. Dechorionieren Sie Wirts- und Spendertiere mit einer Pinzette (falls zutreffend) und betäuben Sie sie, indem Sie sie in kleine Petrischalen legen, die mit raumwarmem RPT gefüllt sind. Warten Sie 5 Minuten, bis die Tiere vollständig betäubt sind, bevor Sie fortfahren.
5. Montieren Sie einzelne Spender- und Wirtstiere: Übertragen Sie die Tiere mit der Pasteur-Pipette und der Pipettenpumpe von RPT auf LMA und übertragen Sie die Tiere dann in kleinen Tropfen LMA auf Objektträger innerhalb der Nagellackkontur. Minimieren Sie die Menge an RPT, die in das LMA übertragen wird, damit das LMA nicht verwässert wird. Bevor sich die LMA verfestigt, verwenden Sie einen Embryo-Pusher, um die Tiere auszurichten, und stellen Sie sicher, dass jedes Tier mit der vorgesehenen Nadeleinstichstelle nach rechts montiert ist und alle Tiere vertikal ausgerichtet sind (Abbildung 2B). Lassen Sie die Agarose vollständig aushärten (~5 min), bevor Sie fortfahren.
   HINWEIS: Da von jedem Spendertier viele Zellen entnommen werden können, ist es effizienter, 2-4 Wirtstiere mit einem Spender auf jedem Objektträger zu montieren.
6. Schneiden Sie mit einem Skalpell einen geraden senkrechten Schnitt durch alle Agarosetropfen direkt rechts von den montierten Tieren (Abbildung 2C). Entfernen Sie lose Agarose mit Labortüchern vom Objektträger.
7. Schneiden Sie mit einem Skalpell Keile aus der Agarose, um die Einstichstelle der Nadel freizulegen (Abbildung 2C). Entfernen Sie lose Agarose mit Labortüchern vom Objektträger.
8. Tragen Sie RPT auf den Objektträger auf, bis die Agarosetropfen vollständig untergetaucht sind (Abbildung 2D).
9. Montieren Sie den vorbereiteten Objektträger auf das Transplantationsmikroskop. Bringen Sie das Spendertier unter dem 40-fach-Ziel in den Fokus. Senken Sie dazu das Objektiv ab, bis es die Oberfläche des Mediums durchbricht, und heben Sie das Objektiv dann auf die gewünschte Fokusebene an.
   HINWEIS: Der Flüssigkeitskontakt mit dem Objektiv muss bis zum Abschluss der Transplantation aufrechterhalten werden (Abbildung 3C).
10. Bringen Sie die fluoreszenzmarkierte(n) Spenderzelle(n) von Interesse in den Fokus; Verschieben Sie dann den Tisch nach links, um die Transplantatnadel zu lokalisieren.
    HINWEIS: Stellen Sie das Mikroskop zu diesem Zeitpunkt nicht auf der Y- oder Z-Achse ein, um sicherzustellen, dass Sie das Spendertier in Abschnitt 5 leicht wiederfinden können.

5. Bereiten Sie die Transplantationsnadel vor.

1. Führen Sie eine Mikropipette in den Mikropipettenabzieher ein und ziehen Sie eine Mikroinjektionsnadel.
   HINWEIS: Die Form der Nadel sollte der Form ähneln, die für die Injektion von Zebrafischembryonen im 1-Zell-Stadium oder das Patch-Klemmen verwendet wird. Wir verwenden einen Mikropipettenabzieher mit folgendem Programm: DRUCK = 500, HITZE = Rampe + 80, ZUG = 90, GESCHWINDIGKEIT = 70, ZEIT = 250 (siehe Materialtabelle), obwohl die korrekten Einstellungen für jeden Abzieher wahrscheinlich empirisch bestimmt werden müssen.
2. Richten Sie die Nadelspitze mit den Unterteilungen des Tischmikrometers unter einem Präparierfernrohr aus. Verwenden Sie das Mikrometer als Messhilfe und verwenden Sie eine geschärfte Pinzette, um die Nadel auf eine Bohrungsgröße zu brechen, die etwas größer ist als der Durchmesser der interessierenden Zellen (Abbildung 3A). Achten Sie darauf, dass der Bruch so sauber wie möglich ist, da gezackte Kanten zum Verstopfen der Nadel beitragen können. HINWEIS: Bei Vagus-Motoneuronen (5-7 μm Durchmesser) sollten die Nadeln auf einen Innendurchmesser von 10 μm gebrochen werden, was einem Außendurchmesser von 20 μm entspricht. Bei Bedarf können Größe, Form und/oder Winkel der Nadelspitze mit einem Microforge oder Microgrinder³⁶ verfeinert werden.
3. Füllen Sie die Nadel mit einer 50-ml-Spritze, die mit leichtem Mineralöl gefüllt und mit einem Pipettenfüller ausgestattet ist, vollständig mit Mineralöl (Abbildung 3B). Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind. Legen Sie die gefüllte Nadel beiseite, bis sie zur Montage bereit ist.
   HINWEIS: Um sicherzustellen, dass keine Luftblasen entstehen, führen Sie den Pipetteneinfüller ganz in die Nadel ein und lassen Sie das Öl ab, während Sie den Einfüller langsam aus der Nadel ziehen.
4. Drehen Sie am Transplantationsgerät den Dreiwege-Absperrhahn so, dass sein langer Arm zur Mikrospritzenpumpe zeigt, und drücken Sie den Kolben der Reservoirspritze, um alle Luftblasen aus der Hydraulikleitung zu spülen. Halten Sie leichten Druck auf den Kolben aufrecht (um einen Rückfluss von Luft in die Leitung zu verhindern) und drehen Sie den Dreiwegehahn so, dass sein langer Arm zur Behälterspritze zeigt.
5. Führen Sie die Nadel in den Halter ein und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen entstehen. Stellen Sie den Winkel der Nadel so ein, dass sie in einem Winkel von 10-15° zur Horizontalen direkt nach links zeigt (Abbildung 3C).
6. Verwenden Sie die groben und feinen Mikromanipulatoren, um die Spitze der Nadel unter das Mikroskopobjektiv zu manövrieren und in den Fokus zu bringen (Abbildung 3D).
   HINWEIS: Die grobe Positionierung der Nadel in der X- und Y-Ebene kann durch direkte Beobachtung des Bereichs unter dem Objektiv erfolgen, während Sie die Nadel manövrieren, da die Nadel den transmittierten Lichtstrahl reflektiert, wenn sie unter dem Objektiv positioniert ist. Die Mikroskopokulare können dann zur Feinpositionierung verwendet werden. Passen Sie während dieses Schritts nicht die Position oder den Fokus des Mikroskoptisches an. Mit den Mikromanipulatoren bringen Sie die Nadelspitze in die vorhandene Fokusposition.
7. Wenn Flüssigkeit in die Nadelspitze hinein oder aus ihr herausfließt, stellen Sie den Druck mit der Spritzenpumpe ein, bis ein stabiler Meniskus zwischen dem Mineralöl und der Ringer-Lösung festgestellt wird (Abbildung 3D).
   HINWEIS: Wenn nach der Stabilisierung eine Ölblase an der Nadelspitze verbleibt, kann sie mit der X-Ebeneneinstellung am groben Mikromanipulator entfernt werden, um die Nadel nach rechts zu bewegen, bis ihre Spitze aus dem RPT gezogen wurde, und dann wieder nach links, bis sie wieder unter dem Objektiv positioniert wird.

6. Transplantation

HINWEIS: Alle Nadelbewegungen sollten mit dem feinen Mikromanipulator für diesen Abschnitt ausgeführt werden.

1. Bewegen Sie den Tisch nach rechts, bis das Spendertier wieder ins Blickfeld gebracht wird, und achten Sie darauf, ein versehentliches Eindringen mit der Nadel zu vermeiden.
2. Zentrieren und fokussieren Sie sich erneut auf die zu transplantierenden Zellen und richten Sie die Nadel auf die Zellen direkt außerhalb des Tieres aus (Abbildung 4A).
   HINWEIS: Möglicherweise müssen Sie häufig zwischen Hellfeld und Fluoreszenz wechseln, um eine korrekte Ausrichtung zu gewährleisten. Die Verwendung eines Grauschutzfilters kann dabei helfen, beides gleichzeitig zu visualisieren.
3. Führen Sie die Nadel in das Spendertier ein.
   HINWEIS: Wiederholte Ein- und Ausbewegungen mit der Nadel können das Eindringen in die Haut erleichtern.
4. Den Ölmeniskus in der Nadelspitze sofort mit der Mikrospritzenpumpe wieder stabilisieren, wie in Schritt 5.7 beschrieben.
5. Positionieren Sie die Nadelspitze an den interessierenden Zellen und saugen Sie sanft mit der Mikrospritzenpumpe (Abbildung 4B).
   HINWEIS: Sanfte Ein- und Ausbewegungen während des Saugens können helfen, Zellen zu lösen.
6. Wenn eine ausreichende Anzahl von Zellen entnommen wurde, entfernen Sie die Nadel vom Spender und stabilisieren Sie sofort den Ölmeniskus in der Nadelspitze mit der Mikrospritzenpumpe.
7. Achten Sie darauf, dass Sie nicht mit der Nadel mit Tieren oder Agarose in Berührung kommen, und positionieren Sie den Tisch neu, um das erste Wirtstier ins Blickfeld zu bringen.
8. Zentrieren und fokussieren Sie sich auf den Bereich, in dem die Zellen platziert werden sollen, und richten Sie die Nadel auf diesen Bereich direkt außerhalb des Tieres aus (Abbildung 4C).
9. Führen Sie die Nadel in das Wirtstier ein und stabilisieren Sie den Ölmeniskus in der Nadelspitze sofort wieder mit der Mikrospritzenpumpe.
10. Positionieren Sie die Nadelspitze an der Abscheidungsstelle und üben Sie mit der Mikrospritzenpumpe leichten Druck aus, bis die richtige Anzahl von Spenderzellen aus der Nadel freigesetzt wird (Abbildung 4D).
    HINWEIS: Wenn Spender- und Wirtszellen mit unterschiedlichen Fluorophoren markiert sind, kann ein Multiband-Filter, der eine gleichzeitige Visualisierung ermöglicht, in dieser Phase sehr hilfreich sein.
11. Entfernen Sie die Nadel von der Hostie und stabilisieren Sie den Ölmeniskus in der Nadelspitze sofort wieder mit der Mikrospritzenpumpe.
12. Wiederholen Sie die Schritte 6.7 bis 6.11 für alle verbleibenden Hosts.

7. Wiederherstellung des Wirtstieres

1. Heben Sie das 40-fach-Objektiv an und manövrieren Sie die Nadel mit dem groben Mikromanipulator zurück in die Ladeposition.
   HINWEIS: Die Nadel kann für mehrere Objektträger wiederverwendet werden.
2. Nehmen Sie den Objektträger aus dem Transplantationsmikroskop und legen Sie ihn unter ein Präpariermikroskop.
3. Steigen Sie von den Wirtstieren ab, indem Sie sie vorsichtig mit einer Pinzette aus dem LMA-Tropfen nehmen. Übertragen Sie die Wirtstiere mit einer Pasteurpipette aus Glas in eine Schüssel mit frischer Ringer-Lösung mit Penicillin/Streptomycin. Stellen Sie sicher, dass sich die Tiere von der Narkose erholen und halten Sie sie in einem Embryo-Inkubator, bis sie für die Aufnahme bereit sind. Euthanasieren Sie die Spendertiere gemäß den genehmigten Protokollen.
   HINWEIS: Unsere Methode zur Euthanasie besteht darin, die Tiere mindestens 1 Stunde lang in ein Eisbad zu tauchen, gefolgt von einem Eintauchen in 500 mg/l Natriumhypochlorit.

Ergebnisse

Die Ergebnisse von Transplantationsexperimenten werden direkt beobachtet, indem fluoreszenzmarkierte Spenderzellen in Wirtstieren zu geeigneten Zeitpunkten nach der Transplantation mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Hier transplantierten wir einzelne anteriore Vagusneuronen bei 3 dpf. Die Wirtstiere wurden dann für 12 oder 48 Stunden inkubiert, anästhesiert, in LMA auf ein Glasdeckglas montiert und mit einem konfokalen Mikroskop abgebildet (Abb...

Diskussion

Die Entwicklungs- und Regenerationsbiologie stützt sich seit über einem Jahrhundert auf Transplantationsexperimente, um die Prinzipien der Zellsignalübertragung und der Bestimmung des Zellschicksals zu untersuchen. Das Zebrafischmodell stellt bereits eine kraftvolle Verschmelzung von genetischen und Transplantationsansätzen dar. Die Transplantation im Blastula- und Gastrula-Stadium, um Mosaiktiere zu erzeugen, ist üblich, aber in Bezug auf die Fragestellungen, die sie beantworten ka...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010