Hochauflösende Zelltransplantation in embryonalen und larvalen Zebrafischen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Transplantation von Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in Zebrafischembryonen und -larven in jedem Stadium zwischen mindestens 1 und 7 Tagen nach der Befruchtung vor.

Zusammenfassung

Entwicklung und Regeneration erfolgen durch einen Prozess genetisch kodierter raumzeitlich dynamischer zellulärer Interaktionen. Der Einsatz von Zelltransplantationen zwischen Tieren, um das Zellschicksal zu verfolgen und Diskrepanzen in den genetischen, räumlichen oder zeitlichen Eigenschaften von Spender- und Wirtszellen zu induzieren, ist ein wirksames Mittel, um die Art dieser Wechselwirkungen zu untersuchen. Organismen wie Küken und Amphibien haben entscheidende Beiträge zu unserem Verständnis von Entwicklung bzw. Regeneration geleistet, vor allem aufgrund ihrer Eignung für Transplantationen. Die Leistungsfähigkeit dieser Modelle wurde jedoch durch die geringe genetische Rückverfolgbarkeit begrenzt. Ebenso sind die wichtigsten genetischen Modellorganismen weniger anfällig für Transplantationen.

Der Zebrafisch ist ein wichtiges genetisches Modell für Entwicklung und Regeneration, und während Zelltransplantationen bei Zebrafischen üblich sind, beschränken sie sich im Allgemeinen auf den Transfer undifferenzierter Zellen in den frühen Entwicklungsstadien der Blastula und Gastrula. In diesem Artikel stellen wir eine einfache und robuste Methode vor, die das Zeitfenster für eine Zebrafischtransplantation auf jedes Embryonal- oder Larvenstadium zwischen mindestens 1 und 7 Tagen nach der Befruchtung erweitert. Die Präzision dieses Ansatzes ermöglicht die Transplantation von nur einer Zelle mit nahezu perfekter räumlicher und zeitlicher Auflösung sowohl bei Spender- als auch bei Wirtstieren. Während wir hier die Transplantation von embryonalen und larvalen Neuronen zur Untersuchung der Nervenentwicklung bzw. -regeneration hervorheben, ist dieser Ansatz auf ein breites Spektrum von Vorläufer- und differenzierten Zelltypen und Forschungsfragen anwendbar.

Einleitung

Die Zelltransplantation hat eine lange und geschichtsträchtige Geschichte als grundlegende Technik in der Entwicklungsbiologie. Um die Wende zum 20^{. Jahrhundert verwandelten} Ansätze, die physikalische Manipulationen zur Störung des Entwicklungsprozesses, einschließlich der Transplantation, nutzten, um die Embryologie von einer beobachtenden Wissenschaft in eine experimentelle Wissenschaft ^1,2. In einem bahnbrechenden Experiment transplantierten Hans Spemann und Hilde Mangold ektopisch die dorsale blastopore Lippe eines Salamanderembryos auf die gegenüberliegende Sei....

Protokoll

Alle Aspekte dieses Verfahrens, die sich auf die Arbeit mit lebenden Zebrafischen beziehen, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Minnesota genehmigt und werden in Übereinstimmung mit den IACUC-Richtlinien durchgeführt.

1. Einmalige Ersteinrichtung des Transplantationsgeräts (Abbildung 1)

1. Montieren Sie das Transplantationsmikroskop gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   HINWEIS: Bei diesem Protokoll wird ein aufrechtes Fluoreszenzmikroskop mit einem 40-fachen Wassertauchobjektiv verwendet.....

Diskussion

Die Entwicklungs- und Regenerationsbiologie stützt sich seit über einem Jahrhundert auf Transplantationsexperimente, um die Prinzipien der Zellsignalübertragung und der Bestimmung des Zellschicksals zu untersuchen. Das Zebrafischmodell stellt bereits eine kraftvolle Verschmelzung von genetischen und Transplantationsansätzen dar. Die Transplantation im Blastula- und Gastrula-Stadium, um Mosaiktiere zu erzeugen, ist üblich, aber in Bezug auf die Fragestellungen, die sie beantworten ka.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010