Trapianto di cellule ad alta risoluzione in zebrafish embrionale e larvale

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per trapiantare cellule con un'elevata risoluzione spaziale e temporale in embrioni e larve di zebrafish in qualsiasi fase tra almeno 1 e 7 giorni dopo la fecondazione.

Abstract

Lo sviluppo e la rigenerazione avvengono attraverso un processo di interazioni cellulari spazio-temporali dinamiche geneticamente codificate. L'uso del trapianto di cellule tra animali per tracciare il destino cellulare e per indurre discrepanze nelle proprietà genetiche, spaziali o temporali delle cellule donatrici e ospiti è un potente mezzo per esaminare la natura di queste interazioni. Organismi come i pulcini e gli anfibi hanno dato un contributo cruciale alla nostra comprensione dello sviluppo e della rigenerazione, rispettivamente, in gran parte a causa della loro adattabilità al trapianto. La potenza di questi modelli, tuttavia, è stata limitata dalla bassa trattabilità genetica. Allo stesso modo, i principali organismi modello genetici hanno una minore adattabilità al trapianto.

Il pesce zebra è un importante modello genetico per lo sviluppo e la rigenerazione e, sebbene il trapianto di cellule sia comune nel pesce zebra, è generalmente limitato al trasferimento di cellule indifferenziate nelle prime fasi di sviluppo della blastula e della gastrula. In questo articolo, presentiamo un metodo semplice e robusto che estende la finestra di trapianto di zebrafish a qualsiasi stadio embrionale o larvale tra almeno 1 e 7 giorni dopo la fecondazione. La precisione di questo approccio consente il trapianto di una sola cellula con una risoluzione spaziale e temporale quasi perfetta sia negli animali donatori che in quelli ospiti. Mentre qui evidenziamo il trapianto di neuroni embrionali e larvali per lo studio dello sviluppo e della rigenerazione nervosa, rispettivamente, questo approccio è applicabile a un'ampia gamma di tipi di cellule progenitrici e differenziate e a domande di ricerca.

Introduzione

Il trapianto di cellule ha una storia lunga e leggendaria come tecnica fondamentale nella biologia dello sviluppo. Intorno alla fine del XX^secolo, gli approcci che utilizzano manipolazioni fisiche per perturbare il processo di sviluppo, compreso il trapianto, hanno trasformato l'embriologia da una scienza osservativa in una sperimentale ^1,2. In un esperimento di riferimento, Hans Spemann e Hilde Mangold hanno trapiantato ectopicamente il labbro dorsale del blastopore di un embrione di salamandra sul lato opposto di un embrione ospite, inducendo il tessuto vicino a f....

Protocollo

Tutti gli aspetti di questa procedura che riguardano il lavoro con il pesce zebra vivo sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) dell'Università del Minnesota e vengono eseguiti in conformità con le linee guida IACUC.

1. Messa a punto iniziale una tantum dell'apparecchio per il trapianto (Figura 1)

1. Assemblare il microscopio per trapianti secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: Questo protocollo utilizza un microscopio a fluorescenza verticale con un obiettivo a immersione in acqua....

Discussione

La biologia dello sviluppo e rigenerativa si è basata per oltre un secolo su esperimenti di trapianto per esaminare i principi della segnalazione cellulare e della determinazione del destino cellulare. Il modello zebrafish rappresenta già una potente fusione di approcci genetici e di trapianto. Il trapianto negli stadi di blastula e gastrula per generare animali a mosaico è comune ma limitato nei tipi di domande che può affrontare. Il trapianto in stadio avanzato è raro, sebbene sia.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010