Transplante de células de alta resolução em peixe-zebra embrionário e larval

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para transplantar células com alta resolução espacial e temporal em embriões e larvas de peixe-zebra em qualquer estágio entre pelo menos 1 e 7 dias após a fertilização.

Resumo

O desenvolvimento e a regeneração ocorrem por um processo de interações celulares espaço-temporais dinâmicas geneticamente codificadas. O uso de transplante de células entre animais para rastrear o destino celular e induzir incompatibilidades nas propriedades genéticas, espaciais ou temporais das células doadoras e hospedeiras é um meio poderoso de examinar a natureza dessas interações. Organismos como pintinhos e anfíbios fizeram contribuições cruciais para nossa compreensão do desenvolvimento e da regeneração, respectivamente, em grande parte devido à sua receptividade ao transplante. O poder desses modelos, no entanto, tem sido limitado pela baixa tratabilidade genética. Da mesma forma, os principais organismos modelo genéticos têm menor receptividade ao transplante.

O peixe-zebra é um importante modelo genético para desenvolvimento e regeneração e, embora o transplante de células seja comum no peixe-zebra, geralmente é limitado à transferência de células indiferenciadas nos estágios iniciais de desenvolvimento da blástula e da gástrula. Neste artigo, apresentamos um método simples e robusto que estende a janela de transplante de peixe-zebra para qualquer estágio embrionário ou larval entre pelo menos 1 e 7 dias após a fertilização. A precisão dessa abordagem permite o transplante de apenas uma célula com resolução espacial e temporal quase perfeita em animais doadores e hospedeiros. Embora destaquemos aqui o transplante de neurônios embrionários e larvais para o estudo do desenvolvimento e regeneração nervosa, respectivamente, essa abordagem é aplicável a uma ampla gama de tipos de células progenitoras e diferenciadas e questões de pesquisa.

Introdução

O transplante de células tem uma longa e célebre história como uma técnica fundamental na biologia do desenvolvimento. Por volta da virada do^século 20, abordagens que usam manipulações físicas para perturbar o processo de desenvolvimento, incluindo o transplante, transformaram a embriologia de uma ciência observacional em uma ciência experimental ^1,2. Em um experimento histórico, Hans Spemann e Hilde Mangold transplantaram ectopicamente o lábio dorsal do blastóporo de um embrião de salamandra para o lado oposto de um embrião hospedeiro, induzindo o tecido próximo a formar um eixo secundário^{do corpo 3}. Este experimento mostrou que as células poderiam induzir outras células a adotar certos destinos e, posteriormente, o transplante se desenvolveu como um método poderoso para interrogar questões críticas na biologia do desenvolvimento em relação à competência e determinação do destino celular, linhagem celular, capacidade indutiva, plasticidade e potência das células-tronco ^1,4,5.

Avanços científicos mais recentes expandiram o poder da abordagem de transplante. Em 1969, a descoberta de Nicole Le Douarin de que a coloração nucleolar poderia distinguir espécies de origem em quimeras de codornas permitiu o rastreamento de células transplantadas e sua progênie⁶. Esse conceito foi posteriormente sobrecarregado pelo advento de marcadores fluorescentes transgênicos e técnicas avançadas de imagem⁵, e foi aproveitado para rastrear o destino celular ^6,7, identificar células-tronco e sua potência ^8,9 e rastrear movimentos celulares durante o desenvolvimento do cérebro¹⁰. Além disso, o surgimento da genética molecular facilitou o transplante entre hospedeiros e doadores de genótipos distintos, apoiando a dissecção precisa de funções autônomas e não autônomas de fatores de desenvolvimento¹¹.

O transplante também fez contribuições importantes para o estudo da regeneração, particularmente em organismos com fortes habilidades regenerativas, como planárias e axolotes, elucidando as identidades e interações celulares que regulam o crescimento e a padronização dos tecidos em regeneração. Estudos de transplante revelaram princípios de potência¹², padronização espacial^13,14, contribuições de tecidos específicos^15,16 e papéis da memória celular^12,17 na regeneração.

O peixe-zebra é um dos principais modelos de vertebrados para o estudo do desenvolvimento e regeneração, inclusive no sistema nervoso, devido aos seus programas genéticos conservados, alta tratabilidade genética, fertilização externa, grande tamanho da ninhada e clareza óptica 18,19,20. O peixe-zebra também é altamente passível de transplante nos estágios iniciais de desenvolvimento. A abordagem mais proeminente é o transplante de células de um embrião de doador marcado para um embrião hospedeiro no estágio de blástula ou gástrula para gerar animais em mosaico. As células transplantadas durante o estágio de blástula se espalham e se dispersam quando a epíboa começa, produzindo um mosaico de células e tecidos marcados em todo o embrião²¹. Os transplantes de gástrula permitem algum direcionamento das células transplantadas de acordo com um mapa de destino aproximado, à medida que o escudo se forma e os eixos AP e DV podem ser determinados²¹. Os mosaicos resultantes foram valiosos para determinar se os genes agem de forma autônoma nas células, testando o comprometimento celular e mapeando o movimento do tecido e a migração celular ao longo do desenvolvimento ^5,11. O peixe-zebra mosaico pode ser gerado de várias maneiras, incluindo eletroporação²², recombinação²³ e transgênese F0²⁴ e mutagênese²⁵, mas o transplante fornece a maior manipulabilidade e precisão no espaço, tempo e número e tipos de células. O estado atual do transplante de peixe-zebra é amplamente restrito a células progenitoras em estágios iniciais, com algumas exceções, incluindo transplante de neurônios motores espinhais^26,27, células ganglionares da retina^28,29 e células da crista neural nas primeiras 10-30 h após a fertilização (hpf) ³⁰ e de células hematopoiéticas e tumorais em peixes-zebra adultos ^5,31. Expandir os métodos de transplante para uma ampla gama de idades, estágios de diferenciação e tipos de células aumentaria muito o poder dessa abordagem para fornecer informações sobre os processos de desenvolvimento e regeneração.

Aqui, demonstramos uma técnica flexível e robusta para transplante de células de alta resolução eficaz em embriões e larvas de peixe-zebra até pelo menos 7 dias após a fertilização. Peixes hospedeiros e doadores transgênicos que expressam proteínas fluorescentes em tecidos-alvo podem ser usados para extrair células únicas e transplantá-las com resolução espacial e temporal quase perfeita. A clareza óptica dos embriões e larvas de peixe-zebra permite que as células transplantadas sejam visualizadas ao vivo à medida que o animal hospedeiro se desenvolve ou se regenera. Essa abordagem foi usada anteriormente para examinar como a dinâmica da sinalização espaço-temporal influencia a identidade neuronal e a orientação do axônio no embrião³² e para examinar a lógica pela qual fatores intrínsecos e extrínsecos promovem a orientação do axônio durante a regeneração em larvas^{de peixes 33}. Embora nos concentremos aqui no transplante de neurônios diferenciados, nosso método é amplamente aplicável a tipos de células indiferenciadas e diferenciadas em muitos estágios e tecidos para abordar questões de desenvolvimento e regeneração.

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Protocolo

Todos os aspectos deste procedimento que dizem respeito ao trabalho com peixes-zebra vivos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Minnesota (IACUC) e são realizados em conformidade com as diretrizes da IACUC.

1. Configuração inicial única do aparelho de transplante (Figura 1)

1. Monte o microscópio de transplante de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: Este protocolo usa um microscópio de fluorescência vertical com uma objetiva de imersão em água de 40x.
2. Monte os micromanipuladores grossos e finos e monte-os no lado direito do microscópio de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: Como é importante que o estágio não se mova na dimensão Z em relação à agulha, usamos um microscópio de estágio fixo com os micromanipuladores montados na base do microscópio. Se um microscópio de platina fixa não estiver disponível, o micromanipulador pode ser montado na platina.
3. Conecte o suporte do microeletrodo à alça do eletrodo e monte no micromanipulador.
4. Conecte um lado da torneira de três vias à bomba de microsseringa. Conecte o outro lado da torneira ao tubo de polietileno usando o adaptador de cromatografia.
5. Conecte o lado oposto do tubo de polietileno ao suporte do microeletrodo usando o adaptador de cromatografia.
6. Encha a seringa do reservatório de 10 mL com óleo mineral leve e monte-a na parte superior da torneira.
7. Encha a bomba de microsseringa e a tubulação (a linha hidráulica) com óleo mineral do reservatório, certificando-se de remover todas as bolhas de ar.
   NOTA: Uma vez que o aparelho esteja configurado, ele exigirá apenas manutenção ocasional da linha hidráulica. A seringa do reservatório pode ser removida e recarregada com óleo mineral, conforme necessário.

2. Prepare empurradores de embriões.

1. Corte um pedaço de linha de pesca de 2 cm e insira-o parcialmente na extremidade estreita de uma ponta de pipeta P1000, deixando ~ 1.5 cm exposto. Prenda a linha de pesca com uma pequena gota de supercola e deixe secar.

3. Prepare soluções.

1. Para preparar 1% de acarose de baixo ponto de fusão dissolvida em meio embrionário (LMA), dissolva a agarose em meio embrionário fervente³⁴. Faça alíquotas de 1-2 mL em tubos de ensaio de fundo redondo e armazene a 4 °C.
2. Prepare a solução de Ringer com penicilina-estreptomicina e tricaína (RPT) combinando os seguintes ingredientes em concentrações finais de 116 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM HEPES pH 7,2, 50 unidades/mL de penicilina e 50ug/mL de estreptomicina, mexendo até dissolver e passando por um filtro a vácuo. Armazene em temperatura ambiente. Adicione tricaína imediatamente antes de usar a uma concentração de 0,02%.

4. Preparar os animais doadores e hospedeiros para transplante.

1. Crie animais hospedeiros e doadores com os genótipos apropriados e com células de interesse marcadas com fluorescência, até a idade desejada.
   NOTA: Para esses transplantes, usamos animais doadores Tg(isl1:EGFPCAAX)^{fh474 32} e Tg(isl1:mRFP)^fh1 animais hospedeiros³⁵ e neurônios transplantados do doador para o hospedeiro de núcleos motores vagos em 3dpf.
2. Prepare as lâminas de transplante aplicando um contorno retangular de esmalte transparente em cada lâmina de vidro (Figura 2A). O esmalte cria uma barreira hidrofóbica para segurar no RPT adicionado na etapa 4.8. Deixe secar completamente antes de usar.
   NOTA: Os slides podem ser preparados com antecedência e armazenados indefinidamente.
3. Derreta uma alíquota de LMA colocando um tubo de LMA em um béquer de 50mL contendo 40mL de água e leve ao micro-ondas por 1 min a 50% da potência ou até derreter. Mantenha a LMA a 40 °C em um aquecedor de banho seco.
4. Descorione os animais hospedeiros e doadores com fórceps (se aplicável) e anestesiá-los colocando-os em pequenas placas de Petri cheias de RPT em temperatura ambiente. Aguarde 5 minutos para que os animais sejam totalmente anestesiados antes de prosseguir.
5. Monte o doador individual e os animais hospedeiros: Usando a pipeta Pasteur e a bomba de pipeta, transfira os animais do RPT para o LMA e, em seguida, transfira os animais em pequenas gotas de LMA para lâminas dentro do contorno do esmalte. Minimize a quantidade de RPT transferida para o LMA para que o LMA não se dilua. Antes que a ML se solidifique, use um empurrador de embriões para orientar os animais, garantindo que cada animal seja montado com o local de inserção da agulha pretendido para a direita e que todos os animais estejam alinhados verticalmente (Figura 2B); Deixe a agarose endurecer completamente (~5 min) antes de prosseguir.
   NOTA: Como muitas células podem ser retiradas de cada animal doador, é mais eficiente montar de 2 a 4 animais hospedeiros com um doador em cada lâmina.
6. Usando um bisturi, corte uma fatia vertical reta em todas as gotas de agarose à direita dos animais montados (Figura 2C). Remova a agarose solta da lâmina com lenços umedecidos.
7. Usando um bisturi, corte cunhas da agarose para expor o local de inserção da agulha (Figura 2C). Remova a agarose solta da lâmina com lenços umedecidos.
8. Aplique RPT na lâmina até que as gotas de agarose estejam totalmente submersas (Figura 2D).
9. Monte a lâmina preparada no microscópio de transplante. Coloque o animal doador em foco sob o objetivo de 40x. Para fazer isso, abaixe a objetiva até que ela quebre a superfície da mídia e, em seguida, levante a objetiva para o plano focal desejado.
   NOTA: O contato com o líquido pela objetiva deve ser mantido até que o transplante seja concluído (Figura 3C).
10. Colocar em foco a(s) célula(s) doadora(s) marcada(s) com fluorescência de interesse; Em seguida, mova o estágio para a esquerda em preparação para localizar a agulha de transplante.
    NOTA: Neste ponto, não ajuste o microscópio nos eixos Y ou Z, para garantir que você possa reencontrar facilmente o animal doador na seção 5.

5. Prepare a agulha de transplante.

1. Insira uma micropipeta no extrator de micropipetas e puxe uma agulha de microinjeção.
   NOTA: O formato da agulha deve ser semelhante ao usado para injeções de embriões de peixe-zebra em estágio de 1 célula ou fixação de remendos. Usamos um extrator de micropipeta com o seguinte programa: PRESSÃO = 500, CALOR = rampa + 80, TRAÇÃO = 90, VELOCIDADE = 70, TEMPO = 250 (consulte a Tabela de Materiais), embora as configurações corretas para cada extrator provavelmente precisem ser determinadas empiricamente.
2. Alinhe a ponta da agulha com as divisões do micrômetro de platina sob um escopo de dissecação. Usando o micrômetro como guia de medição, use uma pinça afiada para quebrar a agulha em um tamanho de furo ligeiramente maior que o diâmetro das células de interesse (Figura 3A). Certifique-se de que a quebra esteja o mais limpa possível, pois as bordas irregulares podem contribuir para o entupimento da agulha. NOTA: Para neurônios motores vagos (5-7 μm de diâmetro), as agulhas devem ser quebradas para um diâmetro interno de 10 μm, o que corresponde a um diâmetro externo de 20 μm. Se necessário, o tamanho, a forma e/ou o ângulo da ponta da agulha podem ser refinados com uma microforja ou micromoedor³⁶.
3. Usando uma seringa de 50 mL cheia de óleo mineral leve e equipada com um enchimento de pipeta, encha completamente a agulha com óleo mineral (Figura 3B). Certifique-se de que não haja bolhas de ar. Deixe a agulha cheia de lado até que esteja pronta para montagem.
   NOTA: Para garantir que não haja bolhas de ar, insira o enchimento da pipeta totalmente na agulha e libere o óleo enquanto puxa lentamente o enchimento para fora da agulha.
4. No aparelho de transplante, gire a torneira de três vias para que seu braço longo fique voltado para a bomba de microsseringa e pressione o êmbolo da seringa do reservatório para liberar todas as bolhas de ar da linha hidráulica. Mantenha uma leve pressão no êmbolo (para evitar o refluxo de ar para a linha) e gire a torneira de três vias de modo que seu braço longo fique voltado para a seringa do reservatório.
5. Insira a agulha no suporte, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar. Ajuste o ângulo da agulha de modo que ela fique voltada diretamente para a esquerda em um ângulo de 10-15° da horizontal (Figura 3C).
6. Use os micromanipuladores grossos e finos para manobrar a ponta da agulha sob a objetiva do microscópio e colocá-la em foco (Figura 3D).
   NOTA: O posicionamento grosseiro da agulha nos planos X e Y pode ser feito observando diretamente a área abaixo da objetiva enquanto você manobra a agulha, pois a agulha refletirá o feixe de luz transmitido quando estiver posicionada sob a objetiva. As oculares do microscópio podem então ser usadas para posicionamento fino. Não ajuste a posição da platina do microscópio ou o foco durante esta etapa. Use os micromanipuladores para colocar a ponta da agulha na posição focal existente.
7. Se o líquido estiver fluindo para dentro ou para fora da ponta da agulha, ajuste a pressão usando a bomba de seringa até que um menisco estável entre o óleo mineral e a solução de Ringer seja observado (Figura 3D).
   NOTA: Se uma bolha de óleo permanecer na ponta da agulha após a estabilização, ela pode ser removida usando o ajuste do plano X no micromanipulador grosso para mover a agulha para a direita até que sua ponta seja retirada do RPT e, em seguida, de volta para a esquerda até que seja reposicionada sob a objetiva.

6. Transplante

NOTA: Todos os movimentos da agulha devem ser feitos usando o micromanipulador fino para esta seção.

1. Mova o palco para a direita até que o animal doador seja trazido de volta à vista, tomando cuidado para evitar a penetração acidental com a agulha.
2. Centralize novamente e concentre-se nas células a serem transplantadas e alinhe a agulha com as células do lado de fora do animal (Figura 4A).
   NOTA: Pode ser necessário alternar entre campo claro e fluorescência com frequência para garantir o alinhamento adequado. O uso de um filtro de densidade neutra pode ajudar na visualização de ambos simultaneamente.
3. Insira a agulha no animal doador.
   NOTA: Movimentos repetidos para dentro e para fora com a agulha podem ajudar a penetrar na pele.
4. Reestabilize imediatamente o menisco de óleo na ponta da agulha com a bomba de microsseringa, conforme descrito na etapa 5.7.
5. Posicione a ponta da agulha contra as células de interesse e aplique uma sucção suave com a bomba de microsseringa (Figura 4B).
   NOTA: Movimentos suaves de entrada e saída durante a sucção podem ajudar a soltar as células.
6. Quando um número adequado de células tiver sido absorvido, remova a agulha do doador e reestabilize imediatamente o menisco de óleo na ponta da agulha com a bomba de microsseringa.
7. Tomando cuidado para evitar o contato com animais ou agarose com a agulha, reposicione o palco para trazer o primeiro animal hospedeiro à vista.
8. Centralize e concentre-se na área em que as células devem ser colocadas e alinhe a agulha com essa região fora do animal (Figura 4C).
9. Insira a agulha no animal hospedeiro e reestabilize imediatamente o menisco de óleo na ponta da agulha com a bomba de microsseringa.
10. Posicione a ponta da agulha no local de deposição e aplique uma leve pressão com a bomba de microsseringa até que o número correto de células doadoras seja liberado da agulha (Figura 4D).
    NOTA: Se as células doadoras e hospedeiras forem marcadas com fluoróforos diferentes, um filtro multibanda para permitir a visualização simultânea pode ser muito útil neste estágio.
11. Remova a agulha do hospedeiro e reestabilize imediatamente o menisco de óleo na ponta da agulha com a bomba de microsseringa.
12. Repita as etapas 6.7 a 6.11 para todos os hosts restantes.

7. Recuperação do animal hospedeiro

1. Levante a objetiva de 40x e use o micromanipulador grosso para manobrar a agulha de volta à posição de carregamento.
   NOTA: A agulha pode ser reutilizada para várias lâminas.
2. Remova a lâmina do microscópio de transplante e coloque-a sob um microscópio de dissecação.
3. Desmonte os animais hospedeiros removendo-os cuidadosamente da queda do LMA com uma pinça. Usando uma pipeta de vidro Pasteur, transfira os animais hospedeiros para um prato com solução de Ringer fresca com penicilina/estreptomicina. Certifique-se de que os animais se recuperem da anestesia e mantenha-os em uma incubadora de embriões até que estejam prontos para a imagem. Eutanásia dos animais doadores de acordo com os protocolos aprovados.
   NOTA: Nosso método de eutanásia é imergir os animais em um banho de gelo por pelo menos 1 hora, seguido de imersão em hipoclorito de sódio 500 mg/L.

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Resultados

Os resultados dos experimentos de transplante são observados diretamente pela visualização de células doadoras marcadas com fluorescência em animais hospedeiros em pontos apropriados após o transplante usando um microscópio de fluorescência. Aqui, transplantamos neurônios vagos anteriores individuais a 3 dpf. Os animais hospedeiros foram então incubados por 12 ou 48 h, anestesiados, montados em ML em uma lamínula de vidro e fotografados com um microscópio confocal (

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Discussão

A biologia do desenvolvimento e regenerativa há mais de um século depende de experimentos de transplante para examinar os princípios de sinalização celular e determinação do destino celular. O modelo do peixe-zebra já representa uma poderosa fusão de abordagens genéticas e de transplante. O transplante nos estágios de blástula e gástrula para gerar animais em mosaico é comum, mas limitado em quais tipos de questões pode abordar. O transplante em estágio avançado é raro,...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010