Transplante de células de alta resolução em peixe-zebra embrionário e larval

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para transplantar células com alta resolução espacial e temporal em embriões e larvas de peixe-zebra em qualquer estágio entre pelo menos 1 e 7 dias após a fertilização.

Resumo

O desenvolvimento e a regeneração ocorrem por um processo de interações celulares espaço-temporais dinâmicas geneticamente codificadas. O uso de transplante de células entre animais para rastrear o destino celular e induzir incompatibilidades nas propriedades genéticas, espaciais ou temporais das células doadoras e hospedeiras é um meio poderoso de examinar a natureza dessas interações. Organismos como pintinhos e anfíbios fizeram contribuições cruciais para nossa compreensão do desenvolvimento e da regeneração, respectivamente, em grande parte devido à sua receptividade ao transplante. O poder desses modelos, no entanto, tem sido limitado pela baixa tratabilidade genética. Da mesma forma, os principais organismos modelo genéticos têm menor receptividade ao transplante.

O peixe-zebra é um importante modelo genético para desenvolvimento e regeneração e, embora o transplante de células seja comum no peixe-zebra, geralmente é limitado à transferência de células indiferenciadas nos estágios iniciais de desenvolvimento da blástula e da gástrula. Neste artigo, apresentamos um método simples e robusto que estende a janela de transplante de peixe-zebra para qualquer estágio embrionário ou larval entre pelo menos 1 e 7 dias após a fertilização. A precisão dessa abordagem permite o transplante de apenas uma célula com resolução espacial e temporal quase perfeita em animais doadores e hospedeiros. Embora destaquemos aqui o transplante de neurônios embrionários e larvais para o estudo do desenvolvimento e regeneração nervosa, respectivamente, essa abordagem é aplicável a uma ampla gama de tipos de células progenitoras e diferenciadas e questões de pesquisa.

Introdução

O transplante de células tem uma longa e célebre história como uma técnica fundamental na biologia do desenvolvimento. Por volta da virada do^século 20, abordagens que usam manipulações físicas para perturbar o processo de desenvolvimento, incluindo o transplante, transformaram a embriologia de uma ciência observacional em uma ciência experimental ^1,2. Em um experimento histórico, Hans Spemann e Hilde Mangold transplantaram ectopicamente o lábio dorsal do blastóporo de um embrião de salamandra para o lado oposto de um embrião hospedeiro, induzindo o tecido próximo a ....

Protocolo

Todos os aspectos deste procedimento que dizem respeito ao trabalho com peixes-zebra vivos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Minnesota (IACUC) e são realizados em conformidade com as diretrizes da IACUC.

1. Configuração inicial única do aparelho de transplante (Figura 1)

1. Monte o microscópio de transplante de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: Este protocolo usa um microscópio de fluorescência vertical com uma objetiva de imersão em água de 40x.
2. Monte os mi....

Discussão

A biologia do desenvolvimento e regenerativa há mais de um século depende de experimentos de transplante para examinar os princípios de sinalização celular e determinação do destino celular. O modelo do peixe-zebra já representa uma poderosa fusão de abordagens genéticas e de transplante. O transplante nos estágios de blástula e gástrula para gerar animais em mosaico é comum, mas limitado em quais tipos de questões pode abordar. O transplante em estágio avançado é raro,.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010