השתלת תאים ברזולוציה גבוהה בדגי זברה עובריים וזחלים

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול להשתלת תאים ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה בעוברים ובזחלים של דגי זברה בכל שלב בין יום אחד לשבעה ימים לפחות לאחר ההפריה.

Abstract

התפתחות והתחדשות מתרחשות בתהליך של אינטראקציות תאיות מרחביות-זמניות דינמיות מקודדות גנטית. השימוש בהשתלת תאים בין בעלי חיים כדי לעקוב אחר גורל התא ולגרום לאי-התאמות בתכונות הגנטיות, המרחביות או הטמפורליות של תאי התורם והמאכסן הוא אמצעי רב עוצמה לבחון את טבען של אינטראקציות אלה. אורגניזמים כמו אפרוחים ודו-חיים תרמו תרומה מכרעת להבנתנו את ההתפתחות וההתחדשות, בהתאמה, במידה רבה בגלל יכולתם להשתלה. כוחם של מודלים אלה, עם זאת, הוגבל על ידי גמישות גנטית נמוכה. כמו כן, לאורגניזמי המודל הגנטי העיקריים יש יכולת נמוכה יותר להשתלה.

דג הזברה הוא מודל גנטי מרכזי להתפתחות והתחדשות, ובעוד שהשתלת תאים נפוצה בדגי זברה, היא מוגבלת בדרך כלל להעברת תאים לא ממוינים בשלבי ההתפתחות המוקדמים של הבלסטולה והגסטרולה. במאמר זה אנו מציגים שיטה פשוטה וחזקה המרחיבה את חלון ההשתלה של דגי זברה לכל שלב עוברי או זחל בין יום אחד לשבעה ימים לפחות לאחר ההפריה. הדיוק של גישה זו מאפשר השתלה של תא אחד בלבד ברזולוציה מרחבית וזמנית כמעט מושלמת הן בבעלי חיים תורמים והן במארחים. בעוד אנו מדגישים כאן את השתלת נוירונים עובריים וזחלים לחקר התפתחות עצבית והתחדשות, בהתאמה, גישה זו ישימה למגוון רחב של סוגי תאים אבותיים ומובחנים ושאלות מחקר.

Introduction

להשתלת תאים יש היסטוריה ארוכה ורבת קומות כטכניקה בסיסית בביולוגיה התפתחותית. בסביבות תחילת המאה^ה-20, גישות המשתמשות במניפולציות פיזיות כדי להפריע לתהליך ההתפתחותי, כולל השתלות, הפכו את האמבריולוגיה ממדע תצפיתי למדע ניסיוני ^1,2. בניסוי פורץ דרך אחד, הנס ספמן והילדה מנגולד השתילו באופן אקטופי את שפת הבלסטופור הגבי של עובר סלמנדרה בצד הנגדי של עובר פונדקאי, וגרמו לרקמה הסמוכה ליצור ציר גוף משני³. ניסוי זה הראה כי תאים יכולים לגרום לתאים אחרים לאמץ גורלות מסוימים, וכתוצאה מכך, ההשתלה התפתחה כשיטה רבת עוצמה לחקר שאלות קריטיות בביולוגיה התפתחותית ל....

Protocol

כל ההיבטים של הליך זה הנוגעים לעבודה עם דגי זברה חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מינסוטה (IACUC) ומבוצעים בהתאם להנחיות IACUC.

1. הקמה ראשונית חד-פעמית של מנגנון השתלה (איור 1)

1. הרכיבו את מיקרוסקופ ההשתלה בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף עם יעד טבילה במים פי 40.
2. להרכיב את המיקרומניפולטורים הגסים והעדינים ולהרכיב אותם בצד ימין של המיקרוסקופ בהתאם להוראות היצרן.
   הערה: מכיוון שחשוב שהשלב לא ינוע בממד Z ביחס למחט, אנו משתמשים במיקרוסקופ שלב קבוע כ....

תוצאות

תוצאות ניסויי ההשתלה נצפות ישירות על ידי הדמיה של תאי תורם המסומנים באופן פלואורסצנטי בבעלי חיים מארחים בנקודות זמן מתאימות לאחר ההשתלה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאן, השתלנו נוירונים תועה קדמיים בודדים ב 3 dpf. חיות מארחות הודגרו במשך 12 או 48 שעות, הורדמו, הורכבו ב-LMA ע.......

Discussion

ביולוגיה התפתחותית ורגנרטיבית מסתמכת כבר למעלה ממאה שנה על ניסויי השתלות כדי לבחון עקרונות של איתות תאי וקביעת גורל התא. מודל דג הזברה כבר מייצג מיזוג רב עוצמה של גישות גנטיות והשתלות. השתלה בשלבי בלסטולה וגסטרולה ליצירת חיות פסיפס היא נפוצה אך מוגבלת באילו סוגי שאלות ה.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL "reservoir syringe"	Fisher Scientific	14-955-459
150 mL disposable vacuum filter, .2 µm, PES	Corning	431153
20 x 12 mm heating block	Corning	480122
3-way stopcock	Braun Medical Inc.	455991
3 x 1 Frosted glass slide	VWR	48312-004
40x water dipping objective	Nikon	MRD07420
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Coarse Manipulator	Narishige	MN-4
Custom microsyringe pump	University of Oregon	N/A	Manufactured by University of Oregon machine shop (tsa.uoregon@gmail.com). A commercially available alternative is listed below.
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	1129500
Eclipse FN1 "Transplant Microscope"	Nikon	N/A
electrode handle	World Precision Instruments	5444
Feather Sterile Surgical Blade, #11	VWR	21899-530
Fine micromanipulator, Three-axis Oil hydraulic	Narishige	MMO-203
HEPES pH 7.2	Sigma-Aldrich	H3375-100G
High Precision #3 Style Scalpel Handle	Fisher Scientific	12-000-163
Kimble Disposable Borosilicate Pasteur Pipette, Wide Tip, 5.75 in	DWK Life Sciences	63A53WT
KIMBLE Chromatography Adapter	DWK Life Sciences	420408-0000
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120
Light Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M3516-1L
LSE digital dry bath heater, 1 block, 120 V	Corning	6875SB
Manual microsyringe pump	World Precision Instruments	MMP	Commercial alternative to custom microsyringe pump
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MPH310
MicroFil Pipette Filler	World Precision Instruments	MF28G67-5
Nail Polish	Electron MIcroscopy Sciences	72180
Nuclease-free water	VWR	82007-334
P-97 Flaming/Brown Type Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97
Penicillin-streptomycin	Sigma-Aldrich	p4458-100ML	5,000 units penicillin and 5 mg streptomycin/mL
pipette pump 10 mL	Bel-Art	37898-0000
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Professional Super Glue	Loctite	LOC1365882
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes	Falcon	352054
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Stage micrometer	Meiji Techno America	MA285
Syringes without Needle, 50 mL	BD Medical	309635
Tricaine Methanosulfonate	Syndel USA	SYNCMGAUS03
Trilene XL smooth casting Fishing line	Berkley	XLFS6-15
Tubing, polyethylene No. 205	BD Medical	427445
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Wiretrol II calibrated micropipettes	Drummond	50002010