利用基因组编辑技术为功能性水稻设计育种

摘要

该协议描述了使用基因组编辑技术以精确、高效和技术简单的方式设计培育抗性淀粉稻品种。

摘要

传统的作物育种方法主要依赖于耗时和劳动密集型的方法，例如传统的杂交和突变育种，在有效引入目标性状和产生多样化的植物种群方面面临挑战。相反，基因组编辑技术的出现带来了范式转变，能够精确和快速地操作植物基因组，从而有意识地引入所需的特征。CRISPR/Cas 系统是应用最广泛的编辑工具之一，研究人员已使用它来研究重要的生物学相关问题。然而，在作物育种中，基因组编辑的精确和有效的工作流程尚未得到明确定义。在这项研究中，我们展示了培育富含高水平抗性淀粉 （RS） 的水稻品种的整个过程，这种功能性状在预防糖尿病和肥胖等疾病中起着至关重要的作用。该工作流程包括几个关键步骤，例如选择功能性 SBEIIb 基因、设计单向导 RNA （sgRNA）、选择合适的基因组编辑载体、确定载体递送方法、进行植物组织培养、基因分型突变和表型分析。此外，还清楚地证明了该过程每个阶段所需的时间框架。该方案不仅简化了育种过程，还提高了性状引入的准确性和效率，从而加速了功能性水稻品种的开发。

引言

传统育种依赖于将性状引入作物或产生具有足够变异的植物种群，这需要长期的田间观察 ^1,2。由于传统育种的局限性，已经开发了基因编辑技术，该技术可以精确修饰作物的基因组以获得植物种群所需的性状³。植物中使用最广泛的基因编辑系统是 CRISPR/Cas（成簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR 相关 Cas 核酸内切酶），它依赖于可编程的 RNA 引导的核酸内切酶在 DNA 中产生靶向双链断裂 （DSB） ^4,5。然后，这些 DSB 被细胞的天然 DNA 修复机制修复 ^6,7，通常会导致引入所需的遗传变化。尽管这项技术已经在各种作物中实施，包括小麦⁸、玉米⁹、大豆¹⁰ 和水稻¹¹，但它主要用于揭示生物学问题。与其在阐明植物基因功能方面的广泛应用相比，将基因编辑技术应用于作物育种的研究仍然....

研究方案

该研究是按照人类研究伦理委员会的指导方针在中国贝拉根生物技术有限公司进行的。在参与之前，向受试者详细解释了研究方案，受试者提供了知情同意。

1. 设计 sgRNA 和构建载体（时间 5-7 天）

注意：二元载体用于表达 CRISPR/Cas-SF01 系统²¹。与 sgRNA 的潜在脱靶位点不匹配不少于 3 个核苷酸 （nt）。sgRNA 接头需要补充粘性末端，粘性末端由编辑载体的 Bsa I 酶消化产生。软件的选择是基于该软件在水稻¹⁴ 中的高效性和特异性，以及它的易用性和对研究小组的可访问性。

1. 导航到 NCBI 网站 （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 以检索 Japonica 中的 OsSBEIIb （LOC4329532） 基因。在 SnapGene 软件中下载并访问参考基因组。
2. 分析 X134 品种 OsSBEIIb 外显子序列中的插入/缺失 （InDel） 和单核苷酸多态性 （SNP），并将其与参考基因组进行比较。利用 NCBI Primer Blast^22<....

讨论

在构建基于 CRISPR/Cas-SF01 的敲低载体的过程中，单向导 RNA （sgRNA） 的精心选择至关重要。这需要采用具有高编辑效率和最小脱靶效应的序列。此外，靶向引物的合成结合了与载体剪接位点匹配的短接头寡核苷酸，确保无缝集成。值得注意的是，与以前需要顺序酶消化、凝胶纯化和连接的方法不同，我们的研究通过将酶切割和连接整合到一个一体化系统中来简化该过程。?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Taq Plus Master Mix II	Vazyme Biotech Co.,Ltd	P213	Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio	Phyto Technology	D309
AAM medium	Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd	M9051C
BsaI-HF	New england biolabs	R3535	Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibiotics	Applygen	APC8250-5	Selection  medium, regeneration medium
Casaminoacid	BBI-Life SciencesCorporation	A603060-0500	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	DL1001	E. coli competent cells
D-Sorbitol	BBI-Life SciencesCorporation	A610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrate	Diamond	A100105-0500	CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	AC1010	Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini Kit	Vazyme Biotech Co.,Ltd	REC01-100	Plasmid isolated
Hygromycin antibiotics	Yeasen	60224ES	co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibiotics	Yeasen	60206ES10	Selection agrobacterium
KOH	Macklin	P766798	CTAB buffer
L-Glutamine	Phyto Technology	G229	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-Proline	Phyto Technology	P698	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134)	-	-	Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechine	MARUMASU	MHR1500A	To produce white rice
Murashige Skoog	Phyto Technology	M519	Root medium, regeneration medium
Myo-inositol	Phyto Technology	I703	Regeneration medium
NaCl	Macklin	S805275	For  YEP media
NB Basal Medium	Phyto Technology	N492	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone	Solarbio	LA8800	For  YEP media
Phytogel	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24793
Pot	Midea group Co.	MB-5E86	For cooking rice
Refrigerator	Haier	BCD-170	Storage the medium
Resistant Starch Assay Kit	Megazyme	K-RSTAR	Measurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibiotics	Sigma	R3501-250MG	Selection agrobacterium
Sodium hypochlorite solution	Macklin	S817439	For seed sterilization
Sucrose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	B21647	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA Ligase	New england biolabs	M0202	Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitor	Medical Equipment & Supply Co., Ltd	Xuetang 582	Detection the blood glucose
Tris-HCL	Macklin	T766494	CTAB buffer
Yeast Agar	Solarbio	LA1370	For  YEP media
YEP media	-	-	Cultivation of Agrobacterium