גידול לפי תכנון לאורז פונקציונלי עם טכנולוגיות עריכת גנום

Summary

הפרוטוקול מתאר גידול זני אורז עמילן עמידים על ידי תכנון באמצעות טכנולוגיות עריכת גנום בצורה מדויקת, יעילה ופשוטה מבחינה טכנית.

Abstract

הגישות הקונבנציונליות לגידול יבולים, המסתמכות בעיקר על שיטות גוזלות זמן ועבודה אינטנסיביות כגון הכלאה מסורתית וגידול מוטציות, מתמודדות עם אתגרים בהחדרה יעילה של תכונות ממוקדות ויצירת אוכלוסיות צמחים מגוונות. לעומת זאת, הופעתן של טכנולוגיות לעריכת גנום הובילה לשינוי פרדיגמה, המאפשר מניפולציה מדויקת ומזורזת של גנומים צמחיים כדי להציג באופן מכוון את המאפיינים הרצויים. אחד מכלי העריכה הנפוצים ביותר הוא מערכת CRISPR/Cas, אשר שימשה חוקרים לחקר בעיות חשובות הקשורות לביולוגיה. עם זאת, זרימת העבודה המדויקת והיעילה של עריכת גנום לא הוגדרה היטב בגידול יבולים. במחקר זה הדגמנו את כל התהליך של גידול זני אורז מועשרים ברמות גבוהות של עמילן עמיד (RS), תכונה פונקציונלית הממלאת תפקיד מכריע במניעת מחלות כגון סוכרת והשמנת יתר. תהליך העבודה כלל מספר שלבים מרכזיים, כגון בחירת גן SBEIIb פונקציונלי, תכנון הרנ"א המנחה היחיד (sgRNA), בחירת וקטור עריכת גנום מתאים, קביעת שיטת העברת הווקטור, ביצוע תרבית רקמת צמחים, מוטציה גנוטיפית וניתוח פנוטיפי. בנוסף, מסגרת הזמן הנדרשת לכל שלב בתהליך הודגמה בבירור. פרוטוקול זה לא רק מייעל את תהליך הרבייה, אלא גם משפר את הדיוק והיעילות של החדרת תכונות, ובכך מאיץ את הפיתוח של זני אורז פונקציונליים.

Introduction

גידול מסורתי מסתמך על החדרת תכונות לגידולים או על ייצור אוכלוסיות צמחים עם מספיק שונות, מה שדורש תצפית שדה ארוכת טווח ^1,2. בשל מגבלות הרבייה המסורתית, פותחה טכנולוגיית עריכת גנים, אשר יכולה לשנות במדויק את הגנום של גידולים כדי להשיג תכונות רצויות של אוכלוסיות צמחים³. מערכת עריכת הגנים הנפוצה ביותר בצמחים היא CRISPR/Cas (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease), אשר מסתמכת על אנדונוקלאז מונחה רנ"א הניתן לתכנות כדי ליצור שברים דו-גדיליים ממוקדים (DSB) בדנ"א ^4,5

Protocol

המחקר נערך בחברת Bellagen Biotechnology Co. Ltd בסין בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי. לפני ההשתתפות, פרוטוקול המחקר הוסבר ביסודיות לנבדקים, שסיפקו הסכמה מדעת.

1. תכנון sgRNA ווקטור בנייה (תזמון 5-7 ימים)

הערה: וקטור בינארי שימש לביטוי מערכת CRISPR/Cas-SF01²¹. אין פחות מ-3 נוקלאוטידים (nt) לא מתאימים לאתר פוטנציאלי מחוץ למטרה עבור sgRNA. מתאם sgRNA צריך להשלים את הקצה הדביק, אשר נוצר על ידי עיכול האנזים Bsa I של וקטור העריכה. בחירת התוכנה התבססה על היעילות הגבוהה והספציפיות המדווחת של התוכנה באורז¹⁴, כמו גם ק....

תוצאות

במחקר הנוכחי, כל ההליכים של גידול אורז פונקציונלי הודגמו על ידי עריכת גנום כדי להשיג זני אורז עמילן עמיד יציב. שילבנו sgRNA המכוון ל-SBEIIb ב-CRISPR/Cas-SF01 (איור משלים 1), החדרנו לאורז באמצעות טרנספורמציית אגרובקטריום, וקיבלנו צמחים מדור E0 לאחר שלבי סינון והשתרשות.......

Discussion

בתהליך הבנייה של וקטורים מבוססי CRISPR/Cas-SF01, בחירה קפדנית של רנ"א חד-מנחה (sgRNA) היא חיונית. זה מחייב אימוץ של רצפים המציגים יעילות עריכה גבוהה עם מינימום אפקטים מחוץ למטרה. בנוסף, הסינתזה של פריימרים ממוקדים משלבת אוליגוס מתאם קצר התואם לאתרי splice של הווקטור, ומבטיח אינטגרציה ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Taq Plus Master Mix II	Vazyme Biotech Co.,Ltd	P213	Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio	Phyto Technology	D309
AAM medium	Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd	M9051C
BsaI-HF	New england biolabs	R3535	Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibiotics	Applygen	APC8250-5	Selection  medium, regeneration medium
Casaminoacid	BBI-Life SciencesCorporation	A603060-0500	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	DL1001	E. coli competent cells
D-Sorbitol	BBI-Life SciencesCorporation	A610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrate	Diamond	A100105-0500	CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	AC1010	Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini Kit	Vazyme Biotech Co.,Ltd	REC01-100	Plasmid isolated
Hygromycin antibiotics	Yeasen	60224ES	co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibiotics	Yeasen	60206ES10	Selection agrobacterium
KOH	Macklin	P766798	CTAB buffer
L-Glutamine	Phyto Technology	G229	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-Proline	Phyto Technology	P698	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134)	-	-	Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechine	MARUMASU	MHR1500A	To produce white rice
Murashige Skoog	Phyto Technology	M519	Root medium, regeneration medium
Myo-inositol	Phyto Technology	I703	Regeneration medium
NaCl	Macklin	S805275	For  YEP media
NB Basal Medium	Phyto Technology	N492	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone	Solarbio	LA8800	For  YEP media
Phytogel	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24793
Pot	Midea group Co.	MB-5E86	For cooking rice
Refrigerator	Haier	BCD-170	Storage the medium
Resistant Starch Assay Kit	Megazyme	K-RSTAR	Measurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibiotics	Sigma	R3501-250MG	Selection agrobacterium
Sodium hypochlorite solution	Macklin	S817439	For seed sterilization
Sucrose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	B21647	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA Ligase	New england biolabs	M0202	Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitor	Medical Equipment & Supply Co., Ltd	Xuetang 582	Detection the blood glucose
Tris-HCL	Macklin	T766494	CTAB buffer
Yeast Agar	Solarbio	LA1370	For  YEP media
YEP media	-	-	Cultivation of Agrobacterium