게놈 편집 기술을 이용한 기능성 벼를 위한 설계에 의한 육종

요약

이 프로토콜은 유전체 편집 기술을 사용하여 정확하고 효율적이며 기술적으로 간단한 방식으로 설계에 따라 저항성 전분 쌀 품종을 육종하는 것을 설명합니다.

초록

전통적인 교잡 및 돌연변이 육종과 같이 주로 시간이 많이 걸리고 노동 집약적인 방법에 의존하는 작물 육종에 대한 기존의 접근 방식은 표적 형질을 효율적으로 도입하고 다양한 식물 개체군을 생성하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 반대로, 게놈 편집 기술의 출현은 패러다임의 변화를 가져왔으며, 식물 게놈의 정확하고 신속한 조작을 가능하게 하여 원하는 특성을 의도적으로 도입할 수 있게 되었습니다. 가장 널리 사용되는 편집 도구 중 하나는 CRISPR/Cas 시스템으로, 연구자들이 중요한 생물학 관련 문제를 연구하는 데 사용해 왔습니다. 그러나 게놈 편집의 정확하고 효과적인 워크플로우는 작물 육종에서 잘 정의되지 않았습니다. 이 연구에서는 당뇨병 및 비만과 같은 질병을 예방하는 데 중요한 역할을 하는 기능적 특성인 저항성 전분(RS)이 높은 수준으로 풍부한 쌀 품종을 육종하는 전 과정을 보여주었습니다. 워크플로우에는 기능성 SBEIIb 유전자 선택, 단일 가이드 RNA(sgRNA) 설계, 적절한 게놈 편집 벡터 선택, 벡터 전달 방법 결정, 식물 조직 배양 수행, 유전형 분석 돌연변이 및 표현형 분석과 같은 몇 가지 주요 단계가 포함되었습니다. 또한 프로세스의 각 단계에 필요한 시간 프레임이 명확하게 입증되었습니다. 이 프로토콜은 육종 과정을 간소화할 뿐만 아니라 형질 도입의 정확성과 효율성을 향상시켜 기능성 쌀 품종의 개발을 가속화합니다.

서문

전통적인 육종은 작물에 형질을 도입하거나 충분한 다양성을 가진 식물 개체군을 생산하는 데 의존하며, 이를 위해서는 장기적인 현장 관찰이 필요하다 ^1,2. 전통적인 육종의 한계로 인해 유전자 편집 기술이 개발되어 작물의 게놈을 정밀하게 수정하여 식물 개체군의 원하는 형질을 얻을 수 있습니다³. 식물에서 가장 널리 사용되는 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease)로, 프로그래밍 가능한 RNA 유도 엔도뉴클레아제에 의존하여 DNA ^4,5에서 표적 이중 가닥 절단(DSB)을 생성합니다. 그런 다음 이러한 DSB는 세포의 자연적인 DNA 복구 메커니즘 ^6,7에 의해 복구되며, 종종 원하는 유전적 변화가 도입됩니다. 이 기술....

프로토콜

이 연구는 인간 연구 윤리 위원회의 지침에 따라 중국의 Bellagen Biotechnology Co. Ltd에서 수행되었습니다. 참여하기 전에 연구 프로토콜은 정보에 입각한 동의를 제공한 피험자에게 철저히 설명되었습니다.

1. sgRNA 및 구축 벡터 설계(타이밍 5-7일)

참고: CRISPR/Cas-SF01 시스템(²¹)을 표현하기 위해 이진 벡터가 사용되었습니다. sgRNA에 대한 잠재적인 off-target site와 3개 미만의 뉴클레오티드(nt) 불일치가 없어야 합니다. sgRNA adapter는 편집 벡터의 Bsa I 효소 분해에 의해 생성되는 끈적한 말단을 보완해야 합니다. 소프트웨어 선택은 rice¹⁴에서 보고된 소프트웨어의 높은 효율성과 특이성, 그리고 연구 그룹에 대한 사용 편의성 및 접근성을 기반으로 했습니다.

1. NCBI 웹 사이트(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로 이동하여 Japonica에서 OsSBEIIb(LOC4329532....

토론

CRISPR/Cas-SF01 기반 knockdown 벡터를 구성하는 과정에서 single-guide RNA(sgRNA)의 세심한 선택이 중요합니다. 이를 위해서는 타겟 이탈 효과를 최소화하면서 높은 편집 효율성을 나타내는 시퀀스를 채택해야 합니다. 또한, 표적 프라이머의 synthesis는 벡터의 splice site와 일치하는 short adapter oligo를 통합하여 원활한 통합을 보장합니다. 특히, 순차적 효소 분해, 겔 정제 및 결찰이 필요.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Taq Plus Master Mix II	Vazyme Biotech Co.,Ltd	P213	Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio	Phyto Technology	D309
AAM medium	Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd	M9051C
BsaI-HF	New england biolabs	R3535	Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibiotics	Applygen	APC8250-5	Selection  medium, regeneration medium
Casaminoacid	BBI-Life SciencesCorporation	A603060-0500	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	DL1001	E. coli competent cells
D-Sorbitol	BBI-Life SciencesCorporation	A610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrate	Diamond	A100105-0500	CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	AC1010	Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini Kit	Vazyme Biotech Co.,Ltd	REC01-100	Plasmid isolated
Hygromycin antibiotics	Yeasen	60224ES	co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibiotics	Yeasen	60206ES10	Selection agrobacterium
KOH	Macklin	P766798	CTAB buffer
L-Glutamine	Phyto Technology	G229	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-Proline	Phyto Technology	P698	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134)	-	-	Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechine	MARUMASU	MHR1500A	To produce white rice
Murashige Skoog	Phyto Technology	M519	Root medium, regeneration medium
Myo-inositol	Phyto Technology	I703	Regeneration medium
NaCl	Macklin	S805275	For  YEP media
NB Basal Medium	Phyto Technology	N492	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone	Solarbio	LA8800	For  YEP media
Phytogel	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24793
Pot	Midea group Co.	MB-5E86	For cooking rice
Refrigerator	Haier	BCD-170	Storage the medium
Resistant Starch Assay Kit	Megazyme	K-RSTAR	Measurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibiotics	Sigma	R3501-250MG	Selection agrobacterium
Sodium hypochlorite solution	Macklin	S817439	For seed sterilization
Sucrose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	B21647	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA Ligase	New england biolabs	M0202	Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitor	Medical Equipment & Supply Co., Ltd	Xuetang 582	Detection the blood glucose
Tris-HCL	Macklin	T766494	CTAB buffer
Yeast Agar	Solarbio	LA1370	For  YEP media
YEP media	-	-	Cultivation of Agrobacterium