Melhoramento por Design para Arroz Funcional com Tecnologias de Edição de Genoma

Resumo

O protocolo descreve a criação de variedades de arroz para amido resistentes por design usando tecnologias de edição de genoma de maneira precisa, eficiente e tecnicamente simples.

Resumo

As abordagens convencionais para o melhoramento de culturas, que dependem predominantemente de métodos demorados e trabalhosos, como hibridização tradicional e melhoramento por mutação, enfrentam desafios na introdução eficiente de características direcionadas e na geração de diversas populações de plantas. Por outro lado, o surgimento de tecnologias de edição de genoma deu início a uma mudança de paradigma, permitindo a manipulação precisa e rápida de genomas de plantas para introduzir intencionalmente as características desejadas. Uma das ferramentas de edição mais difundidas é o sistema CRISPR/Cas, que tem sido usado por pesquisadores para estudar importantes problemas relacionados à biologia. No entanto, o fluxo de trabalho preciso e eficaz da edição do genoma não foi bem definido no melhoramento de culturas. Neste estudo, demonstramos todo o processo de melhoramento de variedades de arroz enriquecido com altos níveis de amido resistente (AR), uma característica funcional que desempenha um papel crucial na prevenção de doenças como diabetes e obesidade. O fluxo de trabalho abrangeu várias etapas importantes, como a seleção do gene SBEIIb funcional, o design do RNA de guia único (sgRNA), a seleção de um vetor de edição de genoma apropriado, a determinação do método de entrega do vetor, a realização de cultura de tecidos vegetais, a mutação de genotipagem e a análise fenotípica. Além disso, o prazo necessário para cada etapa do processo foi claramente demonstrado. Este protocolo não apenas agiliza o processo de melhoramento, mas também aumenta a precisão e a eficiência da introdução de características, acelerando assim o desenvolvimento de variedades funcionais de arroz.

Introdução

O melhoramento tradicional depende da introdução de características nas culturas ou da produção de populações de plantas com variação suficiente, o que requer observação de campo de longo prazo ^1,2. Devido às limitações do melhoramento tradicional, foi desenvolvida a tecnologia de edição de genes, que pode modificar com precisão o genoma das culturas para obter as características desejadas das populações de plantas³. O sistema de edição de genes mais amplamente utilizado em plantas é o CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat....

Protocolo

O estudo foi conduzido na Bellagen Biotechnology Co. Ltd na China, seguindo as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana. Antes de participar, o protocolo do estudo foi minuciosamente explicado aos sujeitos, que forneceram o consentimento informado.

1. Projetando sgRNA e vetor de construção (tempo de 5 a 7 dias)

NOTA: Um vetor binário foi usado para expressar o sistema CRISPR/Cas-SF01²¹. Não tem menos de 3 nucleotídeos (nt) incompatíveis com o potencial local fora do alvo para sgRNA. O adaptador de sgRNA precisa complementar a extremi....

Discussão

No processo de construção de vetores knockdown baseados em CRISPR/Cas-SF01, a seleção meticulosa de RNAs de guia único (sgRNA) é fundamental. Isso exige a adoção de sequências que exibam alta eficiência de edição com efeitos mínimos fora do alvo. Além disso, a síntese de primers de direcionamento incorpora oligos adaptadores curtos que correspondem aos locais de emenda do vetor, garantindo uma integração perfeita. Notavelmente, ao contrário das metodologias anteriores q.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Taq Plus Master Mix II	Vazyme Biotech Co.,Ltd	P213	Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio	Phyto Technology	D309
AAM medium	Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd	M9051C
BsaI-HF	New england biolabs	R3535	Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibiotics	Applygen	APC8250-5	Selection  medium, regeneration medium
Casaminoacid	BBI-Life SciencesCorporation	A603060-0500	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	DL1001	E. coli competent cells
D-Sorbitol	BBI-Life SciencesCorporation	A610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrate	Diamond	A100105-0500	CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	AC1010	Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini Kit	Vazyme Biotech Co.,Ltd	REC01-100	Plasmid isolated
Hygromycin antibiotics	Yeasen	60224ES	co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibiotics	Yeasen	60206ES10	Selection agrobacterium
KOH	Macklin	P766798	CTAB buffer
L-Glutamine	Phyto Technology	G229	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-Proline	Phyto Technology	P698	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134)	-	-	Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechine	MARUMASU	MHR1500A	To produce white rice
Murashige Skoog	Phyto Technology	M519	Root medium, regeneration medium
Myo-inositol	Phyto Technology	I703	Regeneration medium
NaCl	Macklin	S805275	For  YEP media
NB Basal Medium	Phyto Technology	N492	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone	Solarbio	LA8800	For  YEP media
Phytogel	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24793
Pot	Midea group Co.	MB-5E86	For cooking rice
Refrigerator	Haier	BCD-170	Storage the medium
Resistant Starch Assay Kit	Megazyme	K-RSTAR	Measurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibiotics	Sigma	R3501-250MG	Selection agrobacterium
Sodium hypochlorite solution	Macklin	S817439	For seed sterilization
Sucrose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	B21647	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA Ligase	New england biolabs	M0202	Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitor	Medical Equipment & Supply Co., Ltd	Xuetang 582	Detection the blood glucose
Tris-HCL	Macklin	T766494	CTAB buffer
Yeast Agar	Solarbio	LA1370	For  YEP media
YEP media	-	-	Cultivation of Agrobacterium