Mejoramiento por Diseño de Arroz Funcional con Tecnologías de Edición Genómica

Resumen

El protocolo describe el mejoramiento de variedades de arroz con almidón resistentes por diseño utilizando tecnologías de edición genómica de una manera precisa, eficiente y técnicamente simple.

Resumen

Los enfoques convencionales del mejoramiento de cultivos, que se basan predominantemente en métodos que requieren mucho tiempo y mano de obra, como la hibridación tradicional y el mejoramiento por mutación, enfrentan desafíos para introducir de manera eficiente rasgos específicos y generar poblaciones de plantas diversas. Por el contrario, la aparición de las tecnologías de edición del genoma ha marcado el comienzo de un cambio de paradigma, permitiendo la manipulación precisa y acelerada de los genomas de las plantas para introducir intencionadamente las características deseadas. Una de las herramientas de edición más extendidas es el sistema CRISPR/Cas, que ha sido utilizado por los investigadores para estudiar importantes problemas relacionados con la biología. Sin embargo, el flujo de trabajo preciso y eficaz de la edición del genoma no ha sido bien definido en el mejoramiento de cultivos. En este estudio, demostramos todo el proceso de mejora de variedades de arroz enriquecidas con altos niveles de almidón resistente (RS), un rasgo funcional que juega un papel crucial en la prevención de enfermedades como la diabetes y la obesidad. El flujo de trabajo abarcó varios pasos clave, como la selección del gen SBEIIb funcional, el diseño del ARN de guía única (sgRNA), la selección de un vector de edición del genoma adecuado, la determinación del método de administración del vector, la realización del cultivo de tejidos vegetales, la mutación del genotipado y el análisis fenotípico. Además, se ha demostrado claramente el marco temporal necesario para cada etapa del proceso. Este protocolo no solo agiliza el proceso de mejoramiento, sino que también mejora la precisión y la eficiencia de la introducción de rasgos, acelerando así el desarrollo de variedades de arroz funcionales.

Introducción

El mejoramiento tradicional se basa en la introducción de rasgos en los cultivos o en la producción de poblaciones de plantas con suficiente variación, lo que requiere una observación de campo a largo plazo ^1,2. Debido a las limitaciones de la cría tradicional, se ha desarrollado la tecnología de edición genética, que puede modificar con precisión el genoma de los cultivos para obtener los rasgos deseados de las poblaciones de plantas³. El sistema de edición de genes más utilizado en las plantas es CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palin....

Protocolo

El estudio se llevó a cabo en Bellagen Biotechnology Co., Ltd, en China, siguiendo las directrices del comité de ética de la investigación en humanos. Antes de participar, se explicó detalladamente el protocolo del estudio a los sujetos, quienes dieron su consentimiento informado.

1. Diseño de sgRNA y vector de construcción (tiempo 5-7 días)

NOTA: Se utilizó un vector binario para expresar el sistema CRISPR/Cas-SF01²¹. No tienen menos de 3 nucleótidos (nt) de discordancia con un posible sitio fuera del objetivo para el sgRNA. El adaptador de....

Discusión

En el proceso de construcción de vectores knockdown basados en CRISPR/Cas-SF01, la selección meticulosa de ARN de guía única (sgRNA) es fundamental. Esto requiere la adopción de secuencias que exhiban una alta eficiencia de edición con efectos mínimos fuera del objetivo. Además, la síntesis de cebadores dirigidos incorpora oligonucleótidos adaptadores cortos que coinciden con los sitios de empalme del vector, lo que garantiza una integración perfecta. En particular, a diferenc.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Taq Plus Master Mix II	Vazyme Biotech Co.,Ltd	P213	Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio	Phyto Technology	D309
AAM medium	Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd	M9051C
BsaI-HF	New england biolabs	R3535	Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibiotics	Applygen	APC8250-5	Selection  medium, regeneration medium
Casaminoacid	BBI-Life SciencesCorporation	A603060-0500	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	DL1001	E. coli competent cells
D-Sorbitol	BBI-Life SciencesCorporation	A610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrate	Diamond	A100105-0500	CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	AC1010	Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini Kit	Vazyme Biotech Co.,Ltd	REC01-100	Plasmid isolated
Hygromycin antibiotics	Yeasen	60224ES	co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibiotics	Yeasen	60206ES10	Selection agrobacterium
KOH	Macklin	P766798	CTAB buffer
L-Glutamine	Phyto Technology	G229	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-Proline	Phyto Technology	P698	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134)	-	-	Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechine	MARUMASU	MHR1500A	To produce white rice
Murashige Skoog	Phyto Technology	M519	Root medium, regeneration medium
Myo-inositol	Phyto Technology	I703	Regeneration medium
NaCl	Macklin	S805275	For  YEP media
NB Basal Medium	Phyto Technology	N492	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone	Solarbio	LA8800	For  YEP media
Phytogel	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24793
Pot	Midea group Co.	MB-5E86	For cooking rice
Refrigerator	Haier	BCD-170	Storage the medium
Resistant Starch Assay Kit	Megazyme	K-RSTAR	Measurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibiotics	Sigma	R3501-250MG	Selection agrobacterium
Sodium hypochlorite solution	Macklin	S817439	For seed sterilization
Sucrose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	B21647	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA Ligase	New england biolabs	M0202	Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitor	Medical Equipment & Supply Co., Ltd	Xuetang 582	Detection the blood glucose
Tris-HCL	Macklin	T766494	CTAB buffer
Yeast Agar	Solarbio	LA1370	For  YEP media
YEP media	-	-	Cultivation of Agrobacterium