Mejoramiento por Diseño de Arroz Funcional con Tecnologías de Edición Genómica

Resumen

El protocolo describe el mejoramiento de variedades de arroz con almidón resistentes por diseño utilizando tecnologías de edición genómica de una manera precisa, eficiente y técnicamente simple.

Resumen

Los enfoques convencionales del mejoramiento de cultivos, que se basan predominantemente en métodos que requieren mucho tiempo y mano de obra, como la hibridación tradicional y el mejoramiento por mutación, enfrentan desafíos para introducir de manera eficiente rasgos específicos y generar poblaciones de plantas diversas. Por el contrario, la aparición de las tecnologías de edición del genoma ha marcado el comienzo de un cambio de paradigma, permitiendo la manipulación precisa y acelerada de los genomas de las plantas para introducir intencionadamente las características deseadas. Una de las herramientas de edición más extendidas es el sistema CRISPR/Cas, que ha sido utilizado por los investigadores para estudiar importantes problemas relacionados con la biología. Sin embargo, el flujo de trabajo preciso y eficaz de la edición del genoma no ha sido bien definido en el mejoramiento de cultivos. En este estudio, demostramos todo el proceso de mejora de variedades de arroz enriquecidas con altos niveles de almidón resistente (RS), un rasgo funcional que juega un papel crucial en la prevención de enfermedades como la diabetes y la obesidad. El flujo de trabajo abarcó varios pasos clave, como la selección del gen SBEIIb funcional, el diseño del ARN de guía única (sgRNA), la selección de un vector de edición del genoma adecuado, la determinación del método de administración del vector, la realización del cultivo de tejidos vegetales, la mutación del genotipado y el análisis fenotípico. Además, se ha demostrado claramente el marco temporal necesario para cada etapa del proceso. Este protocolo no solo agiliza el proceso de mejoramiento, sino que también mejora la precisión y la eficiencia de la introducción de rasgos, acelerando así el desarrollo de variedades de arroz funcionales.

Introducción

El mejoramiento tradicional se basa en la introducción de rasgos en los cultivos o en la producción de poblaciones de plantas con suficiente variación, lo que requiere una observación de campo a largo plazo ^1,2. Debido a las limitaciones de la cría tradicional, se ha desarrollado la tecnología de edición genética, que puede modificar con precisión el genoma de los cultivos para obtener los rasgos deseados de las poblaciones de plantas³. El sistema de edición de genes más utilizado en las plantas es CRISPR/Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease), que se basa en una endonucleasa guiada por ARN programable para crear roturas de doble cadena (DSB) dirigidas en el ADN ^4,5. Estos DSB son reparados por los mecanismos naturales de reparación del ADN de la célula ^6,7, lo que a menudo resulta en la introducción de los cambios genéticos deseados. Aunque esta tecnología se ha implementado en varios cultivos, como el trigo⁸, el maíz⁹, la soja¹⁰ y el arroz¹¹, se utiliza principalmente para revelar problemas biológicos. En comparación con su amplia aplicación en la elucidación de las funciones de los genes de las plantas, la investigación sobre la aplicación de tecnologías de edición genética al mejoramiento de cultivos sigue siendo relativamente escasa¹².

El proceso de edición genética en los cultivos suele seguir un flujo de trabajo bien definido que abarca varios pasos clave¹³. El primer paso consiste en identificar el gen específico o la región genética que debe modificarse para lograr el rasgo deseado. En segundo lugar, se diseña una estrategia de edición génica, que implica la selección de un sistema de edición génica adecuado (por ejemplo, CRISPR-Cas9 o CRISPR-Cas12) y el diseño de ARN guía específicos para dirigir la endonucleasa al sitio objetivo. En tercer lugar, el sistema de edición de genes se incorpora a un vector de entrega, que se utiliza para introducir la maquinaria de edición en las células vegetales. Estos vectores pueden ser complejos de ADN, ARN o ribonucleoproteínas (RNP). Posteriormente, los vectores de edición génica se introducen en las células vegetales mediante diversos métodos, como la transformación mediada por Agrobacterium, el bombardeo de partículas o la electroporación. Inmediatamente, las células vegetales transformadas se cultivan en condiciones adecuadas para generar callos o tejidos embriogénicos editados genéticamente. Estos tejidos se regeneran en plantas enteras mediante técnicas de cultivo de tejidos. Las plantas regeneradas se someten a una rigurosa caracterización molecular para confirmar la presencia de los cambios genéticos deseados.

Un artículo previo de Tsakirpaloglou et ^al.14 proporciona una visión general del proceso de edición genética, desde el diseño del vector hasta la generación de plántulas editadas, pero no profundiza en el análisis detallado de los rasgos específicos asociados con el gen objetivo ni en la posterior evaluación del rendimiento agronómico o la validación funcional de los cultivos editados. Hemos ido más allá de simplemente demostrar la factibilidad de editar un gen en el arroz. Nuestro trabajo evalúa exhaustivamente el impacto de esta edición en las características bioquímicas, moleculares y agronómicas de las líneas de arroz editadas. Esto incluye la evaluación de la composición del almidón, un factor crítico que influye en la calidad del grano y el valor nutricional, que no se ha explorado ampliamente en estudios previos de edición genética.

El almidón de arroz generalmente consta de ~ 20% de amilosa y ~ 80% de amilopectina¹⁵. SBEIIb es una enzima esencial para la síntesis de amilopectina y se expresa en el endospermo¹⁶. La eliminación de OsSBEIIb por la expresión de ARN de horquilla (ARNi) y microARN aumentó el contenido de almidón resistente^17,18. El almidón resistente es un almidón de sustrato que no puede ser digerido y absorbido en el intestino delgado, pero que puede ser descompuesto en ácidos grasos de cadena corta y gases por ciertas bacterias digestivas en los intestinos. Dado que no se puede descomponer rápidamente, tiene un índice glucémico más bajo en comparación con otros almidones y no causa un aumento rápido del azúcar en la sangre en un corto período de tiempo después de comer, lo que puede aliviar la diabetes hasta cierto punto en la dieta¹⁹. Además, el almidón resistente tiene funciones más fisiológicas, como reducir la respuesta a la insulina, regular la función intestinal, prevenir la acumulación de grasa, facilitar el control de peso y promover la absorción de iones minerales. Por lo tanto, está siendo ampliamente buscado como un nuevo tipo de fibra dietética²⁰.

Para superar estos desafíos y utilizar con éxito las tecnologías de edición de genes para el mejoramiento de variedades funcionales de arroz, hemos refinado y optimizado los protocolos operativos dentro del arroz. Nuestro objetivo ha sido analizar meticulosamente el diseño de los loci de genes diana, seleccionar cuidadosamente las herramientas de edición de genes más adecuadas y realizar un riguroso análisis fenotípico durante todo el proceso de mejora. Como testimonio del poder y la eficiencia de estas tecnologías, presentamos un estudio de caso que muestra el rápido desarrollo de una variedad de arroz funcional enriquecida con almidón de alta resistencia. Este ejemplo subraya el potencial de la edición genética para acelerar el mejoramiento de arroz funcional, abordando la escasez actual de investigación en este campo.

Protocolo

El estudio se llevó a cabo en Bellagen Biotechnology Co., Ltd, en China, siguiendo las directrices del comité de ética de la investigación en humanos. Antes de participar, se explicó detalladamente el protocolo del estudio a los sujetos, quienes dieron su consentimiento informado.

1. Diseño de sgRNA y vector de construcción (tiempo 5-7 días)

NOTA: Se utilizó un vector binario para expresar el sistema CRISPR/Cas-SF01²¹. No tienen menos de 3 nucleótidos (nt) de discordancia con un posible sitio fuera del objetivo para el sgRNA. El adaptador de sgRNA debe complementar el extremo pegajoso, que se genera por la digestión de la enzima Bsa I del vector de edición. La elección del software se basó en la alta eficiencia y especificidad reportada en el arroz¹⁴, así como en su facilidad de uso y accesibilidad para el grupo de investigación.

1. Vaya al sitio web del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) para recuperar el gen OsSBEIIb (LOC4329532) en japónica. Descargue y acceda al genoma de referencia dentro del software SnapGene.
2. Analizar las inserciones/deleciones (InDel) y los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en la secuencia de exones de OsSBEIIb de la variedad X134, comparándola con el genoma de referencia. Utilice NCBI Primer Blast²² para diseñar cebadores que flanqueen las regiones de los exones (Tabla suplementaria 1).
3. Para validar la secuencia de exones del gen OsSBEIIb en X134 mediante secuenciación de Sanger, prepare la reacción de la siguiente manera: 10 μL de tampón de mezcla de polimerasa con 1 μL de cebador directo, 1 μL de cebador inverso, 1 μL de ADNg de tejidos X134 y 7 μL de agua destilada. Ejecute el programa de PCR de la siguiente manera: 95 °C, 3 min; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) con 35 ciclos, y 72 °C, 5 min.
4. Diseñar el sgRNA en la secuencia del exón OsSBEIIb de X134, adhiriéndose al protocolo de Tsakirpaloglou et ^al.14y asegurando que la secuencia PAM sea TTN.
5. Modifique la secuencia de sgRNA agregando oligos -ACAC- en el extremo 5' del cebador directo y agregando oligos -GGCC- en el extremo 5' del cebador inverso. Sintetizar comercialmente los cebadores directos/inversos (para sgRNA).
6. Disuelva los cebadores de avance e inverso a una concentración de 10 μmol/L, tome 1 μL de cada uno y agregue a 8 μL de tampón de recocido (tampón Tris-EDTA + 50 mM de NaCl) y mezcle mediante pipeteo. Colóquelo en la máquina de PCR y ejecute el programa de recocido de la siguiente manera en una máquina de PCR: proceso de enfriamiento lento de 95 °C a 16 °C a 0,1 °C/s.
7. Ensamble el sgRNA en el vector de edición del genoma. Prepare la reacción de la siguiente manera: 20 μL de tampón de mezcla con 0,5 μL de ADN ligasa T4, 1 μL de Bsa I, 2 μL de tampón de restricción 10x, 2 μL de tampón de ADN ligasa T4 10x, 2 μL de cebadores de recocido, 2,5 μL de vector (su volumen se ajusta a la proporción) y 10 μL de agua destilada. En todos los casos, utilice una relación de inserción a vector de 2:1 para lograr la eficiencia del ensamblaje. Ejecute el programa de montaje de PCR como (37 °C, 2 min; 16 °C, 3 min) con 30 ciclos, y 55 °C, 30 min.
8. Transformar el vector resultante en células de E. coli como se describe²³.
9. Diseñe cebadores que flanqueen el sitio de inserción del ARNg dentro del plásmido. Con estos cebadores, realice la amplificación por PCR en colonias individuales para detectar inserciones exitosas. Realice la secuenciación Sanger de los productos de PCR para confirmar el éxito de la clonación y aislar el plásmido²⁴.

2. Transformación de Agrobacterium (tiempo 4 días)

1. Descongele EHA105 Agrobacterium Competent Cell en hielo. Agregue 1-2 μL de ADN plasmídico (que contiene ~ 100-200 ng de ADN) a la suspensión celular y mezcle suavemente.
2. Realice la transformación del choque térmico colocando el tubo sobre hielo durante 5 minutos, nitrógeno líquido durante 5 minutos, choque térmico a 37 °C durante 5 minutos y luego en el baño de hielo durante 5 minutos.
3. Agregue 700 μL de extracto de levadura peptona (YEP) medio, sin antibiótico, al tubo y mezcle suavemente. Recuperar las células en una incubadora agitadora a 28 °C, 200-250 rpm, durante 2-3 h.
4. Centrifugar el cultivo a 2.800 x g durante 1 min. Deseche la mayor parte del sobrenadante, dejando unos 100 μL, y vuelva a suspender las células. Extienda las células en placas de agar YEP que contengan un 1% de antibióticos (Kanamicina y Rifampicina) para la selección de plásmidos. Incubar la placa a 28 °C durante 24-48 h.
5. Raye la placa YEP (con resistencias a los antibióticos) con una punta de pipeta que contenga una sola colonia de Agrobacterium que albergue CRISPR/Cas y transfiera las células a 5 ml de medios líquidos YEP con los antibióticos adecuados. Incubar el líquido a 28 °C durante 3 días.
6. Almacene las cepas de Agrobacterium transformadas como reservas de glicerol a -80 °C para su uso posterior.

3. Transformación del arroz por Agrobacterium (tiempo 3 meses)

NOTA: Se han reportado varios métodos de transformación de plantas para la entrega y expresión de la secuencia de ADN extraño en la célula^{vegetal 25}. Teniendo en cuenta la integración de una sola copia y la baja frecuencia de DSB en el genoma, la transformación mediada por Agrobacterium es el método de elección para integrar el fragmento de ADN de expresión en los cromosomas del arroz.

1. Realizar la transformación de arroz mediada por agrobacterias siguiendo el protocolo en²⁵. Los callos en crecimiento activo (blanco amarillento, relativamente secos y de 1-3 mm de diámetro) son un punto clave para una transformación eficiente. Deseche las semillas con desarrollo de plántulas o callo marrón antes de infectar el callo con Agrobacterium.

4. Genotipado de plantas transgénicas y cosecha de semillas (cronometraje 8 meses)

NOTA: Se cultivarán dos generaciones de arroz para lograr la mutación homocigota y líneas extrañas libres de ADN.

1. Muestreo de tejido de plántula: Trasplante las plantas transgénicas a macetas y cultive durante 1 mes en un invernadero. Para determinar el tipo de mutación, recoja 2-3 mg de hojas frescas de cada macollo de una sola plántula y combínelas en una sola muestra.
2. Extracción de ADN genómico: Seguir un protocolo establecido para la extracción de ADN del genoma de plantas²⁶.
3. Diseño de los cebadores de mutaciones (Tabla suplementaria 1): Diseño de cebadores de PCR para amplificar la región del gen SBEIIb que rodea el sitio diana¹⁴ del sgRNA. El fragmento amplificado tiene una longitud de 493 pb.
4. Genotipado de la mutación: Secuenciar los fragmentos de PCR directamente o clonarlos en un vector de clonación T y secuenciar utilizando el método de Sanger para identificar las mutaciones¹⁴.
5. Cosecha de semillas: Elija las líneas E0 que exhiben mutaciones homocigóticas de cambio de marco y plántelas en un invernadero para obtener semillas.
6. Diseño de los cebadores para identificar el ADN-T: Diseñar tres cebadores específicos para el casete de higromecina, el casete UBI y el casete Cas del constructo para identificar líneas extrañas libres de ADN entre las mutaciones (Tabla suplementaria 1).
7. Confirmación de líneas extranjeras libres de ADN-T: Coseche hojas de plántulas de 2 semanas de edad y extraiga el ADN del genoma de la planta como se describe en el paso 4.2. Realizar PCR genómica con el siguiente programa: 95 °C, 3 min; (95 °C, 20 s- 56 °C, 30 s- 72 °C, 60 s) con 35 ciclos, y 72 °C, 5 min. Esto permite la detección de higromicina, UBI y casete Cas en el genoma de la planta.
8. Analice los productos de PCR mediante electroforesis en gel y seleccione líneas que no muestren bandas, lo que indica que son líneas E1 libres de transgenes. Coseche las semillas de estas líneas seleccionadas.

5. Medición del contenido de almidón resistente (tiempo 4 días)

1. Coseche semillas de plantas mutantes y X134 y déjelas secar naturalmente a temperatura ambiente, manteniendo un contenido de humedad de aproximadamente 13%-15%. Determine el contenido de almidón resistente utilizando el procedimiento pancreático de α-amilosa/amiloglucosidasa (AMG) que se describe a continuación.
2. Active la máquina peladora e introduzca 10 g de granos de arroz en el alimentador para eliminar eficazmente la cáscara de la gluma, lo que da como resultado semillas de arroz procesadas.
3. Transfiera las semillas de arroz peladas al molino de arroz y hágalo funcionar durante 60 s para eliminar la capa de aleurona, produciendo arroz pulido.
4. Coloque el arroz pulido en el molinillo de pañuelos, ajustando la frecuencia de molienda a 60 Hz. Haga funcionar el molinillo durante 15 s, repitiendo el ciclo 2 veces para producir polvo de arroz.
5. Deposite el polvo de arroz molido en una placa de Petri y colóquelo en un horno precalentado. Ajusta la temperatura a 37 °C y déjalo secar durante 12 h.
6. Pesar con precisión 100 mg ± 5 mg de muestras y verter directamente en un tubo de microcentrífuga de 2,0 ml. Golpee suavemente el tubo para asegurarse de que la muestra se asiente en el fondo.
7. Añadir 180 μL de agua purificada al tubo y hervir las muestras durante 20 min en un baño de agua.
8. Deje que las muestras se enfríen a temperatura ambiente, luego introduzca 4 mL de AMG (3 U/mL) que contiene α-amilasa pancreática (10 mg/mL) en cada tubo.
9. Tapar los tubos de forma segura, mezclarlos en un oscilador de vórtice e incubar los tubos a 37 °C durante 16 h con agitación continua.
10. Agregue 4 mL de etanol y mezcle usando un vórtice. Centrifugar el tubo a 1.500 x g durante 10 min.
11. Decantar el sobrenadante, añadir 2 mL de etanol al 50% seguido de 6 mL de IMS al 50%, y mezclar con un vórtice y una centrífuga.
12. Vierta con cuidado el sobrenadante e invierta el tubo para drenar el exceso de líquido. Coloque los tubos en un baño de hielo, agregue 2 mL de 2 M de KOH a cada tubo y revuelva las muestras durante 20 min para resuspender el flóculo y disolver el almidón resistente.
13. Añadir 8 mL de tampón de acetato de sodio 1,2 M (pH 3,8) a cada tubo de ensayo y mezclar con un agitador magnético.
14. Introducir inmediatamente 0,1 mL de AMG (3300 U/mL), mezclar bien e incubar durante 30 min en un baño de agua a 50 °C con mezcla intermitente utilizando un vórtice. A continuación, centrifugar el tubo a 1.500 x g durante 10 min.
15. Transfiera 0,1 mL del sobrenadante a un tubo de vidrio, añada 3 mL de reactivo de glucosa oxidasa/peroxidasa (GOPOD) e incube a 50 °C durante 20 min. Prepare un reactivo en blanco mezclando 0,1 mL de tampón de acetato de sodio de 100 mM y 3 mL de reactivo GOPOD. Prepare los patrones mezclando 0,1 mL de D-glucosa con 3 mL de reactivo GOPOD.
16. Pipetear cuidadosamente 200 μL de cada solución en blanco, la solución que se va a probar y la solución estándar en una placa de 96 pocillos.
17. Mida la absorbancia de cada muestra a 510 nm frente a la solución en blanco y calcule el contenido de almidón resistente utilizando la fórmula proporcionada.
    Almidón resistente (g/100 g) = ΔA × F/W ×9.27
    Donde ΔA = absorbancia leída contra el blanco del reactivo; F = conversión de absorbancia a microgramos (se determina la absorbancia obtenida para 100 μg de D-glucosa en la reacción GOPOD); W = peso seco de la muestra analizada.

6. Respuesta postprandial de la glucemia (cronometraje 5 días)

1. Utilizar los siguientes criterios de inclusión para los participantes: adultos asiático-chinos sanos de entre 18 y 60 años, no fumadores, un índice de masa corporal (IMC) entre 18,5 y 25 kg/^m2 y presión arterial normal (< 140/90 mm. Hg). Utilice los siguientes criterios de exclusión: enfermedades metabólicas (como diabetes, hipertensión, etc.), trastornos gastrointestinales, anomalías del sistema endocrino o enfermedades mentales. Un total de 10 participantes fueron seleccionados y reclutados.
2. Procedimiento de la sesión de prueba (que abarca dos días consecutivos)
   1. Día 0 (día de preparación): Pida a los participantes que mantengan patrones de sueño regulares y una dieta normal durante los primeros 3 días antes de la prueba. La noche anterior a la prueba (después de las 20:00), pida a los participantes que se abstengan de comer comidas con alto contenido de fibra y azúcar. Se desaconseja el ejercicio vigoroso en la mañana del día 1.
   2. Día 1 (Día de prueba): Prepare el arroz blanco moliendo las semillas de arroz, luego enjuague el arroz blanco 2 veces. Llena una olla con 1,5 partes de agua por 1 parte de arroz blanco. Hervir el arroz hasta que el agua se absorba por completo. Apaga el fuego, tapa la olla y déjala reposar durante 10 min.
   3. Asigne aleatoriamente a los 10 participantes a dos grupos iguales: un grupo de prueba para ser alimentado con arroz blanco con almidón resistente y un grupo de control para ser alimentado con arroz blanco X134. Pida a los participantes que descansen durante 10 minutos antes de que comience la prueba.
   4. Esteriliza las yemas de los dedos con alcohol medicinal al 75%. Presione suavemente el dispositivo de lanceta contra la punta del dedo y suelte el resorte para pinchar la piel. Apriete suavemente el dedo para producir una pequeña gota de sangre y toque esta gota con el extremo absorbente de sangre de la tira reactiva en el medidor. El medidor extrae automáticamente la sangre e inicia el proceso de prueba. Espere a que se muestre la lectura de glucosa en sangre.
   5. Consumo de arroz y toma de muestras de sangre: Presente a los participantes 50 g del arroz preparado con 200 ml de agua y pídales que lo coman a un ritmo cómodo dentro de 5-10 minutos. Después de la comida, recoja muestras de sangre venosa en los siguientes momentos: 15 min, 30 min, 60 min, 90 min y 120 min desde el inicio de la comida. Realice el análisis de glucosa en sangre como en el paso 6.2.4.

Resultados

En el presente estudio, se demostraron todos los procedimientos de mejoramiento funcional de arroz mediante la edición del genoma para obtener variedades de arroz con almidón resistentes y estables. Integramos sgRNA dirigido a SBEIIb en CRISPR/Cas-SF01 (Figura suplementaria 1), infiltramos arroz utilizando la transformación de Agrobacterium y obtuvimos plantas de generación E0 después de las etapas de cribado y enraizamiento. Las plantas con pérdi...

Discusión

En el proceso de construcción de vectores knockdown basados en CRISPR/Cas-SF01, la selección meticulosa de ARN de guía única (sgRNA) es fundamental. Esto requiere la adopción de secuencias que exhiban una alta eficiencia de edición con efectos mínimos fuera del objetivo. Además, la síntesis de cebadores dirigidos incorpora oligonucleótidos adaptadores cortos que coinciden con los sitios de empalme del vector, lo que garantiza una integración perfecta. En particular, a diferenc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Taq Plus Master Mix II	Vazyme Biotech Co.,Ltd	P213	Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio	Phyto Technology	D309
AAM medium	Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd	M9051C
BsaI-HF	New england biolabs	R3535	Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibiotics	Applygen	APC8250-5	Selection  medium, regeneration medium
Casaminoacid	BBI-Life SciencesCorporation	A603060-0500	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	DL1001	E. coli competent cells
D-Sorbitol	BBI-Life SciencesCorporation	A610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrate	Diamond	A100105-0500	CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	AC1010	Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini Kit	Vazyme Biotech Co.,Ltd	REC01-100	Plasmid isolated
Hygromycin antibiotics	Yeasen	60224ES	co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibiotics	Yeasen	60206ES10	Selection agrobacterium
KOH	Macklin	P766798	CTAB buffer
L-Glutamine	Phyto Technology	G229	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-Proline	Phyto Technology	P698	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134)	-	-	Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechine	MARUMASU	MHR1500A	To produce white rice
Murashige Skoog	Phyto Technology	M519	Root medium, regeneration medium
Myo-inositol	Phyto Technology	I703	Regeneration medium
NaCl	Macklin	S805275	For  YEP media
NB Basal Medium	Phyto Technology	N492	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone	Solarbio	LA8800	For  YEP media
Phytogel	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24793
Pot	Midea group Co.	MB-5E86	For cooking rice
Refrigerator	Haier	BCD-170	Storage the medium
Resistant Starch Assay Kit	Megazyme	K-RSTAR	Measurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibiotics	Sigma	R3501-250MG	Selection agrobacterium
Sodium hypochlorite solution	Macklin	S817439	For seed sterilization
Sucrose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	B21647	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA Ligase	New england biolabs	M0202	Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitor	Medical Equipment & Supply Co., Ltd	Xuetang 582	Detection the blood glucose
Tris-HCL	Macklin	T766494	CTAB buffer
Yeast Agar	Solarbio	LA1370	For  YEP media
YEP media	-	-	Cultivation of Agrobacterium