ゲノム編集技術による機能性イネの設計育種

要約

このプロトコルでは、ゲノム編集技術を使用して、正確、効率的、かつ技術的に簡単な方法でレジスタントスターチ米の品種を設計的に育種することを説明しています。

要約

従来の作物育種法は、従来の交配法や突然変異育種法など、時間と労力のかかる方法に大きく依存しており、標的形質を効率的に導入し、多様な植物集団を生成するという課題に直面しています。一方、ゲノム編集技術の登場により、パラダイムシフトが起こり、植物ゲノムを正確かつ迅速に操作し、意図的な特性を導入することが可能になりました。最も普及している編集ツールの1つはCRISPR/Casシステムであり、研究者が重要な生物学関連の問題を研究するために使用されてきました。しかし、ゲノム編集の正確で効果的なワークフローは、作物育種では十分に定義されていません。本研究では、糖尿病や肥満などの疾病予防に重要な役割を果たす機能形質であるレジスタントスターチ(RS)を多く含むイネ品種の育種の全過程を実証しました。このワークフローには、機能 的なSBEIIb 遺伝子の選択、シングルガイドRNA(sgRNA)の設計、適切なゲノム編集ベクターの選択、ベクター送達方法の決定、植物組織培養の実施、遺伝子型決定変異、表現型解析など、いくつかの重要なステップが含まれていました。さらに、プロセスの各段階に必要な時間枠が明確に示されています。このプロトコルは、育種プロセスを合理化するだけでなく、形質導入の精度と効率を向上させ、それによって機能的なイネ品種の開発を加速します。

概要

従来の育種は、作物に形質を導入したり、十分なバリエーションを持つ植物個体群を生産したりすることに依存しており、これには長期的な野外観察が必要です^1,2。従来の育種法には限界があるため、作物のゲノムを精密に改変して植物集団の望ましい形質を得ることができる遺伝子編集技術が開発され^{てきた3。}植物で最も広く使用されている遺伝子編集システムは、CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease)で、これはプログラム可能なRNA誘導エンドヌクレアーゼに依存し^てDNA4,5に標的二本鎖切断(DSB)を作り出します。これらのDSBは、細胞の自然なDNA修復メカニズム^6,7によって修復され、多くの場合、所望の遺伝的変化が導入される。この技術は、小麦⁸、トウモロコシ

プロトコル

この研究は、ヒト研究倫理委員会のガイドラインに従って、中国のBellagen Biotechnology Co.Ltdで実施されました。参加する前に、研究プロトコルが被験者に徹底的に説明され、被験者はインフォームドコンセントを提供しました。

1. sgRNAと構築ベクターの設計(5-7日)

注:バイナリベクトルを使用して、CRISPR/Cas-SF01システム²¹を表現しました。sgRNAの潜在的なオフターゲット部位とのヌクレオチド(nt)のミスマッチが3つ未満でないこと。sgRNAアダプターは、編集ベクターのBsa I酵素消化によって生成される粘着末端を補完する必要があります。ソフトウェアの選択は、イネ¹⁴で報告されたソフトウェアの高い効率と特異性、および研究グループにとっての使いやすさとアクセスのしやすさに基づいていました。

1. NCBIのウェブサイト(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)に移動し、JaponicaのOsSBEIIb(LOC4329532)遺伝子を取得します。SnapGeneソフトウェア内のリファレンスゲノムをダウンロードしてアクセ....

ディスカッション

CRISPR/Cas-SF01ベースのノックダウンベクターを構築するプロセスでは、シングルガイドRNA(sgRNA)の細心の注意を払って選択することが極めて重要です。そのため、オフターゲット効果を最小限に抑えながら高い編集効率を示す配列を採用する必要があります。さらに、ターゲティングプライマーの合成には、ベクターのスプライス部位に一致する短いアダプターオリゴ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Taq Plus Master Mix II	Vazyme Biotech Co.,Ltd	P213	Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio	Phyto Technology	D309
AAM medium	Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd	M9051C
BsaI-HF	New england biolabs	R3535	Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibiotics	Applygen	APC8250-5	Selection  medium, regeneration medium
Casaminoacid	BBI-Life SciencesCorporation	A603060-0500	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	DL1001	E. coli competent cells
D-Sorbitol	BBI-Life SciencesCorporation	A610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrate	Diamond	A100105-0500	CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	AC1010	Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini Kit	Vazyme Biotech Co.,Ltd	REC01-100	Plasmid isolated
Hygromycin antibiotics	Yeasen	60224ES	co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibiotics	Yeasen	60206ES10	Selection agrobacterium
KOH	Macklin	P766798	CTAB buffer
L-Glutamine	Phyto Technology	G229	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-Proline	Phyto Technology	P698	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134)	-	-	Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechine	MARUMASU	MHR1500A	To produce white rice
Murashige Skoog	Phyto Technology	M519	Root medium, regeneration medium
Myo-inositol	Phyto Technology	I703	Regeneration medium
NaCl	Macklin	S805275	For  YEP media
NB Basal Medium	Phyto Technology	N492	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone	Solarbio	LA8800	For  YEP media
Phytogel	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24793
Pot	Midea group Co.	MB-5E86	For cooking rice
Refrigerator	Haier	BCD-170	Storage the medium
Resistant Starch Assay Kit	Megazyme	K-RSTAR	Measurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibiotics	Sigma	R3501-250MG	Selection agrobacterium
Sodium hypochlorite solution	Macklin	S817439	For seed sterilization
Sucrose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	B21647	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA Ligase	New england biolabs	M0202	Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitor	Medical Equipment & Supply Co., Ltd	Xuetang 582	Detection the blood glucose
Tris-HCL	Macklin	T766494	CTAB buffer
Yeast Agar	Solarbio	LA1370	For  YEP media
YEP media	-	-	Cultivation of Agrobacterium