ゲノム編集技術による機能性イネの設計育種

要約

このプロトコルでは、ゲノム編集技術を使用して、正確、効率的、かつ技術的に簡単な方法でレジスタントスターチ米の品種を設計的に育種することを説明しています。

要約

従来の作物育種法は、従来の交配法や突然変異育種法など、時間と労力のかかる方法に大きく依存しており、標的形質を効率的に導入し、多様な植物集団を生成するという課題に直面しています。一方、ゲノム編集技術の登場により、パラダイムシフトが起こり、植物ゲノムを正確かつ迅速に操作し、意図的な特性を導入することが可能になりました。最も普及している編集ツールの1つはCRISPR/Casシステムであり、研究者が重要な生物学関連の問題を研究するために使用されてきました。しかし、ゲノム編集の正確で効果的なワークフローは、作物育種では十分に定義されていません。本研究では、糖尿病や肥満などの疾病予防に重要な役割を果たす機能形質であるレジスタントスターチ(RS)を多く含むイネ品種の育種の全過程を実証しました。このワークフローには、機能 的なSBEIIb 遺伝子の選択、シングルガイドRNA(sgRNA)の設計、適切なゲノム編集ベクターの選択、ベクター送達方法の決定、植物組織培養の実施、遺伝子型決定変異、表現型解析など、いくつかの重要なステップが含まれていました。さらに、プロセスの各段階に必要な時間枠が明確に示されています。このプロトコルは、育種プロセスを合理化するだけでなく、形質導入の精度と効率を向上させ、それによって機能的なイネ品種の開発を加速します。

概要

従来の育種は、作物に形質を導入したり、十分なバリエーションを持つ植物個体群を生産したりすることに依存しており、これには長期的な野外観察が必要です^1,2。従来の育種法には限界があるため、作物のゲノムを精密に改変して植物集団の望ましい形質を得ることができる遺伝子編集技術が開発され^{てきた3。}植物で最も広く使用されている遺伝子編集システムは、CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Cas endonuclease)で、これはプログラム可能なRNA誘導エンドヌクレアーゼに依存し^てDNA4,5に標的二本鎖切断(DSB)を作り出します。これらのDSBは、細胞の自然なDNA修復メカニズム^6,7によって修復され、多くの場合、所望の遺伝的変化が導入される。この技術は、小麦⁸、トウモロコシ⁹、大豆¹⁰、イネ¹¹など、さまざまな作物に実用化されていますが、主に生物学的な問題を明らかにするために使用されています。植物の遺伝子機能の解明に広く応用されているにもかかわらず、遺伝子編集技術を作物育種に応用する研究は比較的少ないままである¹²。

作物の遺伝子編集のプロセスは、通常、いくつかの主要なステップ¹³を含む明確に定義されたワークフローに従います。最初のステップは、目的の形質を達成するために修飾する必要がある特定の遺伝子または遺伝的領域を特定することです。次に、適切な遺伝子編集システム(CRISPR-Cas9またはCRISPR-Cas12など)の選択と、エンドヌクレアーゼを標的部位に向けるための特定のガイドRNAの設計を含む、遺伝子編集戦略が設計されます。第三に、遺伝子編集システムをデリバリーベクターに組み込み、それを使用して編集装置を植物細胞に導入します。これらのベクターは、DNA、RNA、またはリボ核タンパク質(RNP)複合体であり得る。その後、遺伝子編集ベクターは、 アグロバクテリウム媒介形質転換、粒子衝撃、エレクトロポレーションなどのさまざまな方法で植物細胞に導入されます。形質転換した植物細胞は、すぐに適切な条件下で培養され、遺伝子編集されたカルスまたは胚形成組織が生成されます。これらの組織は、組織培養技術によって植物全体に再生されます。再生された植物は、目的の遺伝的変化の存在を確認するために、厳密な分子特性評価を受けます。

Tsakirpaloglouらによる以前の論文¹⁴ では、ベクター設計から編集苗の生成までの遺伝子編集プロセスの広範な概要を提供していますが、標的遺伝子に関連する特定の形質の詳細な分析や、その後の農業性能の評価や編集された作物の機能検証については掘り下げていません。私たちは、単にイネの遺伝子編集の実現可能性を実証するだけではありません。私たちの仕事は、この編集が編集されたイネ系統の生化学的、分子的、および農業的形質に与える影響を包括的に評価します。これには、穀物の品質と栄養価に影響を与える重要な要素であるデンプン組成の評価が含まれますが、これは以前の遺伝子編集研究では広く調査されていませんでした。

米デンプンは、通常、~20%のアミロースと~80%のアミロペクチン¹⁵で構成されています。SBEIIbはアミロペクチン合成に必須の酵素であり、胚乳¹⁶で発現しています。ヘアピンRNA(RNAi)およびマイクロRNA発現によるOsSBEIIbのノックダウンは、レジスタントスターチ含有量を増加させた^17,18。レジスタントスターチは、小腸で消化および吸収することができないが、腸内の特定の消化細菌によって短鎖脂肪酸およびガスに分解することができる基質デンプンです。すぐに分解できないため、他のでんぷんに比べてグリセミック指数が低く、食後短時間で血糖値が急激に上昇することもないため、ダイエットで糖尿病をある程度緩和することができます¹⁹。さらに、レジスタントスターチは、インスリン反応の低下、腸機能の調節、脂肪の蓄積の防止、体重管理の促進、ミネラルイオンの吸収の促進など、より多くの生理学的機能を持っています。そのため、新しいタイプの食物繊維²⁰として広く追求されている。

これらの課題を克服し、遺伝子編集技術を機能的なイネ品種の育種にうまく活用するために、イネ内の操作プロトコルを洗練し、最適化しました。私たちは、標的遺伝子座のデザインを綿密に解析し、最適な遺伝子編集ツールを慎重に選択し、育種プロセス全体を通じて厳密な表現型解析を行うことに重点を置いてきました。これらの技術の力と効率性の証として、高耐性デンプンを豊富に含む機能性イネ品種の急速な発展を示すケーススタディを紹介します。この例は、遺伝子編集が機能性イネの育種を加速させる可能性を強調しており、この分野での研究が現在不足している問題に対処しています。

プロトコル

この研究は、ヒト研究倫理委員会のガイドラインに従って、中国のBellagen Biotechnology Co.Ltdで実施されました。参加する前に、研究プロトコルが被験者に徹底的に説明され、被験者はインフォームドコンセントを提供しました。

1. sgRNAと構築ベクターの設計(5-7日)

注:バイナリベクトルを使用して、CRISPR/Cas-SF01システム²¹を表現しました。sgRNAの潜在的なオフターゲット部位とのヌクレオチド(nt)のミスマッチが3つ未満でないこと。sgRNAアダプターは、編集ベクターのBsa I酵素消化によって生成される粘着末端を補完する必要があります。ソフトウェアの選択は、イネ¹⁴で報告されたソフトウェアの高い効率と特異性、および研究グループにとっての使いやすさとアクセスのしやすさに基づいていました。

1. NCBIのウェブサイト(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)に移動し、JaponicaのOsSBEIIb(LOC4329532)遺伝子を取得します。SnapGeneソフトウェア内のリファレンスゲノムをダウンロードしてアクセスします。
2. X134品種の OsSBEIIb のエクソン配列における挿入/欠失(InDel)および一塩基多型(SNP)を解析し、参照ゲノムと比較します。NCBI Primer Blast²² を使用して、エクソン領域に隣接するプライマーを設計します(補足表1)。
3. X134の OsSBEIIb 遺伝子のエクソン配列をサンガーシーケンシングによりバリデーションするには、10 μLのポリメラーゼミックスバッファーと1 μLのフォワードプライマー、1 μLのリバースプライマー、1 μLのX134組織由来のgDNAおよび7 μLの蒸留水で反応を調製します。PCRプログラムを次のように実行します:95°C、3分。(95 °C、20 s- 56 °C、30 s- 72 °C、60 s)、35サイクル、72 °C、5分。
4. Tsakirpaloglou et ^al.14プロトコルに準拠し、PAM 配列が TTN であることを確認しながら、X134 の OsSBEIIb エクソン配列上の sgRNA を設計します。
5. フォワードプライマーの5'末端に-ACAC-オリゴを添加し、リバースプライマーの5'末端に-GGCC-オリゴを添加して、sgRNA配列を修飾します。フォワード/リバースプライマー(sgRNA用)を商業的に合成します。
6. フォワードプライマーとリバースプライマーを10 μmol/Lの濃度に溶解し、それぞれ1 μLを取り、8 μLのアニールバッファー(Tris-EDTAバッファー+ 50 mM NaCl)を加えてピペッティングで混合します。PCR装置に入れ、PCR装置で次のようにアニーリングプログラムを実行します:0.1°C/sで95°Cから16°Cの低速冷却プロセス。
7. sgRNAをゲノム編集ベクターに組み立てます。20 μLのミックスバッファーと0.5 μLのT4 DNAリガーゼ、1 μLのBsa I、2 μLの10x Restriction buffer、2 μLの10x T4 DNAリガーゼバッファー、2 μLのアニーリングプライマー、2.5 μLのベクター(容量は比率に合わせて調整されます)、10 μLの蒸留水。いずれの場合も、2:1の挿入対ベクトル比を使用して、組み立て効率を達成します。PCRアセンブルプログラムを(37°C、2分、16°C、3分)として30サイクル、55°C、30分で実行します。
8. 得られたベクターを説明²³のように大腸菌細胞に変換する。
9. プラスミド内のgRNA挿入部位に隣接するプライマーを設計します。これらのプライマーを使用して、個々のコロニーでPCR増幅を行い、挿入が成功したかどうかをスクリーニングします。PCR産物のサンガーシーケンシングを実施して、クローニングが成功したことを確認し、プラスミド²⁴を分離します。

2. アグロバクテリウム の形質転換(4日後)

1. EHA105 Agrobacterium Competent Cell を氷上で解凍します。1-2 μL のプラスミド DNA (100~200 ng の DNA を含む) を細胞懸濁液に加え、穏やかに混合します。
2. チューブを氷上に5分間、液体窒素を5分間、37°Cで5分間ヒートショックした後、氷浴に5分間入れて、ヒートショック変換を行います。
3. 抗生物質を含まない700 μLの酵母抽出物ペプトン(YEP)培地をチューブに加え、穏やかに混合します。28°C、200〜250rpmの振とうインキュベーターで細胞を2〜3時間回収します。
4. 培養物を2,800 x g で1分間遠心分離します。上清の大部分を捨て、約100μLを残し、細胞を再懸濁します。プラスミド選択のために、1%抗生物質(カナマイシンおよびリファンピシン)を含むYEP寒天プレートに細胞を広げます。プレートを28°Cで24〜48時間インキュベートします。
5. CRISPR/Casを保有する アグロバクテリウム の単一コロニーを含むピペットチップでYEP(抗生物質耐性を含む)プレートに線を引いて、細胞を適切な抗生物質を含む5 mLのYEP液体培地に移します。液体を28°Cで3日間インキュベートします。
6. 形質転換した アグロバクテリウム 株をグリセロールストックとして-80°Cで保存し、さらに使用します。

3. アグロバクテリウムによるイネの形質転換(タイミング3ヶ月)

注:植物細胞²⁵における外来DNA配列の送達および発現について、いくつかの植物形質転換方法が報告されている。ゲノム中のDSBのシングルコピー統合と低頻度を考慮すると、アグロバクテリウム媒介形質転換は、発現DNAフラグメントをイネ染色体に統合するための選択方法です。

1. ²⁵のプロトコルに従って、イネのアグロバクテリウム媒介形質転換を実行します。活発に成長しているカリ(黄白色、比較的乾燥、直径1〜3mm)は、効率的な形質転換のポイントです。カルスをアグロバクテリウムに感染させる前に、苗の発達または茶色のカルスで種子を捨ててください。

4. 遺伝子組換え植物のジェノタイピングと種子収穫(タイミング8ヶ月)

注:ホモ接合型突然変異と外来DNAフリー系統を達成するために、2世代のイネが栽培されます。

1. 苗組織のサンプリング:トランスジェニック植物を鉢に移植し、温室で1ヶ月間育てます。突然変異タイプを分析するには、1つの苗の各分げつから2〜3 mgの新鮮な葉を収集し、それらを1つのサンプルに組み合わせます。
2. ゲノムDNAの抽出:植物ゲノムDNA抽出²⁶のための確立されたプロトコルに従ってください。
3. 突然変異プライマーの設計(補足表1):sgRNA標的部位¹⁴の周囲のSBEIIb遺伝子領域を増幅するためのPCRプライマーを設計します。増幅されたフラグメントの長さは493 bpです。
4. 突然変異のジェノタイピング:PCRフラグメントを直接シーケンシングするか、またはそれらをTクローンベクターにクローニングし、サンガー法を使用して突然変異を同定します¹⁴。
5. 種子の収穫:ホモ接合体フレームシフト変異を示すE0系統を選択し、温室に植えて種子を入手します。
6. T-DNAを同定するためのプライマーの設計:ハイグロマイシンカセット、UBIカセット、およびコンストラクトのCasセットの3つの特異的プライマーを設計して、変異中の外来DNAフリーラインを同定します(補足表1)。
7. 外来T-DNAフリー系統の確認:生後2週間の苗から葉を収穫し、ステップ4.2で説明したように植物ゲノムDNAを抽出します。次のプログラムでゲノムPCRを実施します:95°C、3分。(95 °C、20 s- 56 °C、30 s- 72 °C、60 s)、35サイクル、72 °C、5分。これにより、植物ゲノム中のハイグロマイシン、UBI、およびCasカセットの検出が可能になります。
8. ゲル電気泳動でPCR産物を分析し、バンドを示さないラインを選択します。これは、導入遺伝子フリーのE1ラインであることを示します。これらの選択した系統から種子を収穫します。

5.レジスタントスターチ含有量測定(タイミング4日)

1. 変異体およびX134植物の種子を収穫し、室温で自然乾燥させ、水分含有量を約13%〜15%に保ちます。以下に概説する膵臓のα-アミロース/アミログルコシダーゼ(AMG)手順を使用して、レジスタントスターチ含有量を決定します。
2. ピーリングマシンを作動させ、10gの米粒をフィーダーに導入して、グラムシェルを効率的に取り除き、加工された米の種子をもたらします。
3. 皮をむいた米の種子を精米機に移し、60秒間操作してアリューロン層を排除し、精白された米を生成します。
4. 精米した米をティッシュグラインダーに入れ、挽く周波数を60Hzに調整し、グラインダーを15秒間実行し、サイクルを2回繰り返して米粉を生成します。
5. 挽いた米粉をペトリ皿に入れ、予熱したオーブンに入れます。温度を37°Cに設定し、12時間乾燥させます。
6. 100 mg±5 mgのサンプルを正確に秤量し、2.0 mLの微量遠心チューブに直接注ぎます。チューブを軽くたたいて、サンプルが底に落ち着くようにします。
7. 180 μLの精製水をチューブに加え、サンプルをウォーターバスで20分間煮沸します。
8. サンプルを室温まで冷ましてから、膵臓α-アミラーゼ(10 mg/mL)を含む 4 mL の AMG(10 mg/mL)を各チューブに導入します。
9. チューブをしっかりとキャッピングし、ボルテックスオシレーターで混合し、チューブを37°Cで16時間連続的に攪拌しながらインキュベートします。
10. エタノール4mLを加え、ボルテックスで混合します。チューブを1,500 x g で10分間遠心分離します。
11. 上清をデカントし、2 mLの50%エタノールを加え、続いて6 mLの50%IMSを加え、ボルテックスと遠心分離機を使用して混合します。
12. 上清を慎重に注ぎ落とし、チューブを反転させて余分な液体を排出します。チューブを氷浴に入れ、各チューブに2 mLの2 M KOHを加え、サンプルを20分間攪拌してフロックを再懸濁し、レジスタントスターチを溶解します。
13. 8 mLの1.2 M酢酸ナトリウム緩衝液(pH 3.8)を各試験管に加え、マグネチックスターラーを使用して混合します。
14. 直ちに0.1 mLのAMG(3300 U/mL)を導入し、十分に混合し、ボルテックスを用いて断続的に混合しながら50°Cの水浴中で30分間インキュベートします。次に、チューブを1,500 x g で10分間遠心分離します。
15. 上清0.1 mLをガラス管に移し、3 mLのグルコースオキシダーゼ/ペルオキシダーゼ(GOPOD)試薬を加え、50°Cで20分間インキュベートします。0.1 mLの100 mM酢酸ナトリウムバッファーと3 mLのGOPOD試薬を混合して、試薬ブランクを調製します。0.1 mLのD-グルコースと3 mLのGOPOD試薬を混合して標準試料を調製します。
16. 各ブランク溶液、試験する溶液、および標準溶液の200μLを慎重にピペットで96ウェルプレートに入れます。
17. ブランク溶液に対する510 nmで各サンプルの吸光度を測定し、提供された式を使用してレジスタントスターチ含有量を計算します。
    レジスタントスターチ(g / 100 g)=ΔA×f / w×9.27
    ここで、ΔA =試薬ブランクに対して読み取られた吸光度。F =吸光度からマイクログラムへの変換(GOPOD反応中の100μgのD-グルコースについて得られる吸光度が決定される)。W = 分析したサンプルの乾燥重量。

6. 食後血糖値反応(計時5日後)

1. 参加者には、次の選択基準を使用します: 18 歳から 60 歳までの健康なアジア系中国人成人、非喫煙者、ボディ マス インデックス (BMI) が 18.5 から 25 kg/m²、および正常な血圧 (< 140/90 mm. Hg)。次の除外基準を使用してください:代謝性疾患(糖尿病、高血圧など)、胃腸障害、内分泌系の異常、または精神疾患。合計10人の参加者がスクリーニングされ、募集されました。
2. テストセッションの手順(連続する2日間)
   1. 0日目(準備日):参加者に、テスト前の最初の3日間は、定期的な睡眠パターンと通常の食事を維持するように依頼します。テスト前日の夜(20:00以降)は、参加者に高繊維質・高糖質の食事を控えるようお願いします。1日目の朝は激しい運動はお勧めしません。
   2. 1日目(テスト日):米の種を精米して白米を準備し、白米を2回すすぎます。鍋に水1.5部と白米1部を入れます。水が完全に吸収されるまでご飯を茹でます。火を止め、鍋に蓋をして10分ほど休ませます。
   3. 10人の参加者を2つの等しいグループにランダムに割り当てます:1つのテストグループに耐性デンプン白米を給餌し、1つの対照グループにX134白米を給餌します。テストが始まる前に、参加者に10分間休むように依頼します。
   4. 指先を75%の医療用アルコールで滅菌します。ランセットデバイスを指先にそっと押し付け、スプリングを放して皮膚を刺します。指をそっと握って小さな血滴を生成し、この液滴をメーター内のテストストリップの血液吸収端に触れます。メーターは自動的に血液を吸い込み、検査プロセスを開始します。血糖値が表示されるのを待ちます。
   5. 米の摂取と採血:準備した米50gと水200mLを参加者に提示し、これを5〜10分以内に快適なペースで食べるように依頼します。食後、食事開始から15分後、30分後、60分後、90分後、120分後に静脈血を採取してください。ステップ6.2.4のように血糖分析を実行します。

結果

本研究では、ゲノム編集により機能性イネの育種の全過程をゲノム編集により明らかにし、安定したレジスタントスターチイネ品種を作製した。 SBEIIb を標的とするsgRNAをCRISPR/Cas-SF01に組み込み(補足図1)、 Agrobacterium 形質転換を用いてイネに浸透させ、スクリーニングと発根の段階でE0世代の植物を得た。遺伝子機能が失われた植物をスクリ?...

ディスカッション

CRISPR/Cas-SF01ベースのノックダウンベクターを構築するプロセスでは、シングルガイドRNA(sgRNA)の細心の注意を払って選択することが極めて重要です。そのため、オフターゲット効果を最小限に抑えながら高い編集効率を示す配列を採用する必要があります。さらに、ターゲティングプライマーの合成には、ベクターのスプライス部位に一致する短いアダプターオリゴ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Taq Plus Master Mix II	Vazyme Biotech Co.,Ltd	P213	Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio	Phyto Technology	D309
AAM medium	Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd	M9051C
BsaI-HF	New england biolabs	R3535	Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibiotics	Applygen	APC8250-5	Selection  medium, regeneration medium
Casaminoacid	BBI-Life SciencesCorporation	A603060-0500	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	DL1001	E. coli competent cells
D-Sorbitol	BBI-Life SciencesCorporation	A610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrate	Diamond	A100105-0500	CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	AC1010	Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini Kit	Vazyme Biotech Co.,Ltd	REC01-100	Plasmid isolated
Hygromycin antibiotics	Yeasen	60224ES	co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibiotics	Yeasen	60206ES10	Selection agrobacterium
KOH	Macklin	P766798	CTAB buffer
L-Glutamine	Phyto Technology	G229	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-Proline	Phyto Technology	P698	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134)	-	-	Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechine	MARUMASU	MHR1500A	To produce white rice
Murashige Skoog	Phyto Technology	M519	Root medium, regeneration medium
Myo-inositol	Phyto Technology	I703	Regeneration medium
NaCl	Macklin	S805275	For  YEP media
NB Basal Medium	Phyto Technology	N492	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone	Solarbio	LA8800	For  YEP media
Phytogel	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24793
Pot	Midea group Co.	MB-5E86	For cooking rice
Refrigerator	Haier	BCD-170	Storage the medium
Resistant Starch Assay Kit	Megazyme	K-RSTAR	Measurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibiotics	Sigma	R3501-250MG	Selection agrobacterium
Sodium hypochlorite solution	Macklin	S817439	For seed sterilization
Sucrose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	B21647	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA Ligase	New england biolabs	M0202	Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitor	Medical Equipment & Supply Co., Ltd	Xuetang 582	Detection the blood glucose
Tris-HCL	Macklin	T766494	CTAB buffer
Yeast Agar	Solarbio	LA1370	For  YEP media
YEP media	-	-	Cultivation of Agrobacterium