Sélection dès la conception d’un riz fonctionnel avec des technologies d’édition du génome

Résumé

Le protocole décrit la sélection de variétés de riz à l’amidon résistantes par conception à l’aide de technologies d’édition du génome de manière précise, efficace et techniquement simple.

Résumé

Les approches conventionnelles de la sélection des cultures, qui reposent principalement sur des méthodes longues et laborieuses telles que l’hybridation traditionnelle et la sélection par mutation, se heurtent à des défis pour introduire efficacement des caractères ciblés et générer des populations végétales diversifiées. À l’inverse, l’émergence des technologies d’édition du génome a inauguré un changement de paradigme, permettant la manipulation précise et accélérée des génomes des plantes pour introduire intentionnellement les caractéristiques souhaitées. L’un des outils d’édition les plus répandus est le système CRISPR/Cas, qui a été utilisé par les chercheurs pour étudier d’importants problèmes liés à la biologie. Cependant, le flux de travail précis et efficace de l’édition du génome n’a pas été bien défini dans la sélection des cultures. Dans cette étude, nous avons démontré l’ensemble du processus de sélection de variétés de riz enrichies de niveaux élevés d’amidon résistant (RS), un trait fonctionnel qui joue un rôle crucial dans la prévention de maladies telles que le diabète et l’obésité. Le flux de travail comprenait plusieurs étapes clés, telles que la sélection du gène SBEIIb fonctionnel, la conception de l’ARN guide unique (ARNsg), la sélection d’un vecteur d’édition du génome approprié, la détermination de la méthode d’administration du vecteur, la réalisation d’une culture de tissus végétaux, le génotypage des mutations et l’analyse phénotypique. De plus, le calendrier nécessaire pour chaque étape du processus a été clairement démontré. Ce protocole permet non seulement de rationaliser le processus de sélection, mais aussi d’améliorer la précision et l’efficacité de l’introduction des caractères, accélérant ainsi le développement de variétés de riz fonctionnelles.

Introduction

La sélection traditionnelle repose sur l’introduction de caractères dans les cultures ou sur la production de populations végétales suffisamment variées, ce qui nécessite une observation à long terme sur le terrain ^1,2. En raison des limites de la sélection traditionnelle, la technologie d’édition de gènes a été développée, qui peut modifier avec précision le génome des cultures pour obtenir les caractéristiques souhaitées des populations végétales³. Le système d’édition de gènes le plus largement utilisé chez les plantes est CRISPR/Cas (Clustered Regul....

Protocole

L’étude a été menée chez Bellagen Biotechnology Co. Ltd en Chine conformément aux directives du comité d’éthique de la recherche sur l’homme. Avant de participer, le protocole de l’étude a été expliqué en détail aux sujets, qui ont fourni un consentement éclairé.

1. Conception de l’ARNsg et du vecteur de construction (durée 5-7 jours)

REMARQUE : Un vecteur binaire a été utilisé pour exprimer le système CRISPR/Cas-SF01²¹. Ne pas avoir moins de 3 nucléotides (nt) de décalage avec un site hors cible potentiel pour l’ARNsg. L’adaptateur d’ARNsg ....

Discussion

Dans le processus de construction de vecteurs knockdown basés sur CRISPR/Cas-SF01, une sélection méticuleuse d’ARN monoguide (ARNsg) est essentielle. Cela nécessite l’adoption de séquences qui présentent une efficacité de montage élevée avec un minimum d’effets hors cible. De plus, la synthèse des amorces de ciblage incorpore de courts oligos adaptateurs correspondant aux sites d’épissage du vecteur, assurant une intégration transparente. Notamment, contrairement aux .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Taq Plus Master Mix II	Vazyme Biotech Co.,Ltd	P213	Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio	Phyto Technology	D309
AAM medium	Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd	M9051C
BsaI-HF	New england biolabs	R3535	Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibiotics	Applygen	APC8250-5	Selection  medium, regeneration medium
Casaminoacid	BBI-Life SciencesCorporation	A603060-0500	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	DL1001	E. coli competent cells
D-Sorbitol	BBI-Life SciencesCorporation	A610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrate	Diamond	A100105-0500	CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	AC1010	Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini Kit	Vazyme Biotech Co.,Ltd	REC01-100	Plasmid isolated
Hygromycin antibiotics	Yeasen	60224ES	co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibiotics	Yeasen	60206ES10	Selection agrobacterium
KOH	Macklin	P766798	CTAB buffer
L-Glutamine	Phyto Technology	G229	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-Proline	Phyto Technology	P698	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134)	-	-	Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechine	MARUMASU	MHR1500A	To produce white rice
Murashige Skoog	Phyto Technology	M519	Root medium, regeneration medium
Myo-inositol	Phyto Technology	I703	Regeneration medium
NaCl	Macklin	S805275	For  YEP media
NB Basal Medium	Phyto Technology	N492	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone	Solarbio	LA8800	For  YEP media
Phytogel	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24793
Pot	Midea group Co.	MB-5E86	For cooking rice
Refrigerator	Haier	BCD-170	Storage the medium
Resistant Starch Assay Kit	Megazyme	K-RSTAR	Measurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibiotics	Sigma	R3501-250MG	Selection agrobacterium
Sodium hypochlorite solution	Macklin	S817439	For seed sterilization
Sucrose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	B21647	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA Ligase	New england biolabs	M0202	Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitor	Medical Equipment & Supply Co., Ltd	Xuetang 582	Detection the blood glucose
Tris-HCL	Macklin	T766494	CTAB buffer
Yeast Agar	Solarbio	LA1370	For  YEP media
YEP media	-	-	Cultivation of Agrobacterium