Genom Düzenleme Teknolojileri ile Fonksiyonel Pirinç için Tasarım Yoluyla Islah

Özet

Protokol, genom düzenleme teknolojilerini hassas, verimli ve teknik olarak basit bir şekilde kullanarak tasarım yoluyla ıslaha dirençli nişasta pirinç çeşitlerini açıklar.

Özet

Ağırlıklı olarak geleneksel hibridizasyon ve mutasyon ıslahı gibi zaman alıcı ve emek yoğun yöntemlere dayanan mahsul ıslahına yönelik geleneksel yaklaşımlar, hedeflenen özelliklerin verimli bir şekilde tanıtılmasında ve çeşitli bitki popülasyonlarının oluşturulmasında zorluklarla karşı karşıyadır. Tersine, genom düzenleme teknolojilerinin ortaya çıkışı, istenen özellikleri kasıtlı olarak ortaya çıkarmak için bitki genomlarının hassas ve hızlandırılmış manipülasyonunu sağlayan bir paradigma kaymasına yol açmıştır. En yaygın düzenleme araçlarından biri, araştırmacılar tarafından biyoloji ile ilgili önemli sorunları incelemek için kullanılan CRISPR / Cas sistemidir. Bununla birlikte, genom düzenlemenin kesin ve etkili iş akışı, mahsul ıslahında iyi tanımlanmamıştır. Bu çalışmada, diyabet ve obezite gibi hastalıkların önlenmesinde çok önemli bir rol oynayan fonksiyonel bir özellik olan yüksek seviyelerde dirençli nişasta (RS) ile zenginleştirilmiş pirinç çeşitlerinin ıslah sürecinin tamamını gösterdik. İş akışı, fonksiyonel SBEIIb geninin seçimi, tek kılavuzlu RNA'nın (sgRNA) tasarlanması, uygun bir genom düzenleme vektörünün seçilmesi, vektör dağıtım yönteminin belirlenmesi, bitki doku kültürünün yürütülmesi, genotipleme mutasyonu ve fenotipik analiz gibi birkaç önemli adımı kapsıyordu. Ek olarak, sürecin her aşaması için gerekli olan zaman çerçevesi açıkça gösterilmiştir. Bu protokol sadece ıslah sürecini kolaylaştırmakla kalmaz, aynı zamanda özellik tanıtımının doğruluğunu ve verimliliğini de artırır, böylece fonksiyonel pirinç çeşitlerinin geliştirilmesini hızlandırır.

Giriş

Geleneksel ıslah, ekinlere özelliklerin eklenmesine veya yeterli varyasyona sahip bitki popülasyonlarının üretilmesine dayanır, bu da uzun süreli saha gözlemi gerektirir ^1,2. Geleneksel ıslahın sınırlamaları nedeniyle, bitki popülasyonlarının istenen özelliklerini elde etmek için mahsullerin genomunu hassas bir şekilde değiştirebilen gen düzenleme teknolojisi geliştirilmiştir³. Bitkilerde en yaygın kullanılan gen düzenleme sistemi, DNA'da hedeflenen çift iplikli kırılmalar (DSB'ler) oluşturmak için programlanabilir bir RNA güdümlü endonükleaza dayanan C....

Protokol

Çalışma, insan araştırmaları etik komitesinin yönergelerini izleyerek Çin'deki Bellagen Biotechnology Co. Ltd'de gerçekleştirildi. Katılımdan önce, bilgilendirilmiş onam veren deneklere çalışma protokolü kapsamlı bir şekilde açıklandı.

1. sgRNA ve yapım vektörünün tasarlanması (zamanlama 5-7 gün)

NOT: CRISPR/Cas-SF01 sistemi^21'i ifade etmek için ikili bir vektör kullanılmıştır. sgRNA için potansiyel hedef dışı bölge ile 3'ten az nükleotid (nt) uyumsuzluğuna sahip değildir. SgRNA adaptörünün, düzenleme vektörünün Bsa I enzim sindirimi tarafın....

Tartışmalar

CRISPR/Cas-SF01 tabanlı yıkım vektörleri oluşturma sürecinde, tek kılavuzlu RNA'ların (sgRNA) titiz seçimi çok önemlidir. Bu, minimum hedef dışı efektle yüksek düzenleme verimliliği sergileyen dizilerin benimsenmesini gerektirir. Ek olarak, hedefleme primerlerinin sentezi, vektörün ek yerleriyle eşleşen kısa adaptör oligolarını içerir ve sorunsuz entegrasyon sağlar. Özellikle, sıralı enzimatik sindirim, jel saflaştırma ve ligasyon gerektiren önceki metodo.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Taq Plus Master Mix II	Vazyme Biotech Co.,Ltd	P213	Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio	Phyto Technology	D309
AAM medium	Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd	M9051C
BsaI-HF	New england biolabs	R3535	Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibiotics	Applygen	APC8250-5	Selection  medium, regeneration medium
Casaminoacid	BBI-Life SciencesCorporation	A603060-0500	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	DL1001	E. coli competent cells
D-Sorbitol	BBI-Life SciencesCorporation	A610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrate	Diamond	A100105-0500	CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	AC1010	Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini Kit	Vazyme Biotech Co.,Ltd	REC01-100	Plasmid isolated
Hygromycin antibiotics	Yeasen	60224ES	co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibiotics	Yeasen	60206ES10	Selection agrobacterium
KOH	Macklin	P766798	CTAB buffer
L-Glutamine	Phyto Technology	G229	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-Proline	Phyto Technology	P698	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134)	-	-	Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechine	MARUMASU	MHR1500A	To produce white rice
Murashige Skoog	Phyto Technology	M519	Root medium, regeneration medium
Myo-inositol	Phyto Technology	I703	Regeneration medium
NaCl	Macklin	S805275	For  YEP media
NB Basal Medium	Phyto Technology	N492	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone	Solarbio	LA8800	For  YEP media
Phytogel	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24793
Pot	Midea group Co.	MB-5E86	For cooking rice
Refrigerator	Haier	BCD-170	Storage the medium
Resistant Starch Assay Kit	Megazyme	K-RSTAR	Measurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibiotics	Sigma	R3501-250MG	Selection agrobacterium
Sodium hypochlorite solution	Macklin	S817439	For seed sterilization
Sucrose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	B21647	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA Ligase	New england biolabs	M0202	Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitor	Medical Equipment & Supply Co., Ltd	Xuetang 582	Detection the blood glucose
Tris-HCL	Macklin	T766494	CTAB buffer
Yeast Agar	Solarbio	LA1370	For  YEP media
YEP media	-	-	Cultivation of Agrobacterium