זוהי שיטה חדשנית להערכת הורמון glucocorticoid, קורטיזול, פרווה קואלה. הוא מספק סמן ביולוגי חדשני להערכת מתח כרוני בקואלות. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי היא שיטה רגישה מאוד לשחזור עם זמן תפנית מהיר למדי בין הכנת מדגם והערכה הורמונלית.
טכניקה זו מאפשרת הערכה כמותית של מתח כרוני בקואלות, שהוא כלי ניהול קליני שימושי ביותר. עוזר לי עם הליך זה הוא דילן פוקס, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה לאחזר את הפרווה מאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס ולתת לו להפשיר בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, לשקול את הפרווה על איזון דיוק אנליטי מעבדה. מניחים 60 מיליגרם של הפרווה לתוך צינור צנטריפוגה שנשקל מראש ומתויג 1.5 מיליליטר צנטריפוגה ולחזור על זה עד 18 צינורות מלאים. באמצעות פיפטה, להוסיף מיליליטר אחד של 100% HPLC כיתה isopropanol לכל צינור.
מערבולת הדגימות במשך 30 שניות. מסננים כל דגימה עם מסננת מיקרו-דיוק 0.5 מיליליטר כדי להשיג הפרדת נוזלים ופרווה, ומשליכים את הנוזל לתוך מיכל פסולת. מניחים כל דגימת פרווה בסירת שקילה מפלסטיק.
לאחר מכן מניחים את הסירות במשקל לתוך יבוש ואקום ולהשאיר במשך שלושה ימים כדי לתת את הפרווה להתייבש. לאחר הפרווה יבש לחלוטין, מניחים כל מדגם לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה שכותרתו 1.5 מיליליטר. מניחים כל דגימה במפעל חרוזים עם שלושה גם פדיות פלדה כרום ומרוכלים במשך שתי דקות ב-30 שייקים לשנייה.
חזור על העברה זו עם 100% מתנול כיתה אנליטית ו 100% כיתה אנליטית isopropanol עד 18 צינורות סה"כ מולאו. לאחר מכן, השתמש פיפטה להעביר מיליליטר אחד של טכניקת החילוץ הראשונה לתוך שישה צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר המכיל את דגימת הפרווה. מכסים כל צינור, ולהשתמש בשייקר כדי להידגר אותם בטמפרטורת החדר עם פעימות קבועות לפחות 12 שעות.
לאחר מכן מסננים את הדגימות עם מסננת מיקרו-דיוק של 0.5 מיליליטר. השתמש פיפטה כדי להעביר את הנוזל לתוך צינור microcentrifuge חדש שכותרתו 1.5 מיליליטר, תוך הבטחה כי הפרווה מושלכת כראוי. במכסה המנוע אדים, לגמרי לנסות את תמצית ממס תחת זרם של אדי חנקן.
לאחר מכן, מחדש את המדגם המיובש עם 400 microliters של מאגר assay ו 100 microliters של 100% אתנול כיתה אנליטית. כדי להפוך את הפקדים, בחר תחילה דגימות מבעלי חיים עם חשיפה ידועה ללחץ. כדי להפוך את בריכת תמצית, לקחת 20 microliters של תמצית מכל מדגם עד נפח כולל של 200 microliters מתקבל.
אחסן את בריכת התמצית במינוס 80 מעלות צלזיוס עד מוכן לרוץ assays. כאשר אתה מוכן, השג את גורם הדילול עבור 30% ו- 70% נקודות מחייבות מגרף הקבליות עבור התמצית מול תקן הקורטיזול, ולהשתמש במאגר ההתמדה כדי לדלל את מאגר הדגימה כראוי כדי ליצור את הפקדים הגבוהים והנמומים. באמצעות ערכת קורטיזול מסחרית להגדיר צלחת רצועה 96 באר כולל דגימות, פקדים, תקני קורטיזול, בארות כריכה לא ספציפיות, בארות מחייבות מקסימלית על פי הוראות הספק.
השתמש בגיליון פריסת הלוחיות הכלול החוברת ערכה כדי לפרט את המיקומים של דגימות, פקדים וסטנדרטים. לאחר מכן, בצע את תהליך מיצוי הורמון הפרווה שתואר בעבר כדי להשיג 100% פרווה קואלה שחולצו מתנול. הכינו את הרהגנטים של ערכת הקורטיזול בהתאם להוראות היצרן.
פיפטה 50 מיקרוליטרים של דגימות או תקנים לתוך בארות הצלחת. פיפטה 75 מיקרוליטרים של מאגר בדיקה לתוך בארות שאינן מחייבות, ו-50 מיקרוליטרים של מאגר בדיקה לתוך בארות הכריכה המרביות. באמצעות פיפטה מהדר להוסיף 25 microliters של קורטיזול חידה לכל באר.
לאחר מכן, פיפטה 25 מיקרוליטר של נוגדן הקורטיזול לתוך כל באר, למעט בארות לא ספציפיות מחייבות. הקישו בעדינות על דפנות הצלחת כדי לוודא שהריג'ים מעורבבים היטב. מכסים את הצלחת עם איטום הצלחת, ולהשתמש שייקר מסלולית לנער בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.
לאחר מכן, להסיר את חותם הצלחת, ולשוכך את צלחת היטב על ידי כביסה כל גם עם 300 microliters של חיץ לשטוף ארבע פעמים. ואז לייבש את הצלחת על ידי הקשה עליו על מגבות סופג נקי. פיפטה 100 מיקרוליטרים של מצע tetramethylbenzidine לכל באר.
מניחים את איטום הצלחת על צלחת היטב, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר מכן, פיפטה 50 מיקרוליטרים של פתרון עצירה לתוך כל באר. מעבירים את הלוחית לקורא לוחות המסוגל לקרוא 450 ננומטר, ולחשב את ריכוז ההורמונים הסופי כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
במחקר זה, זיהוי החיבור של מטבוליטים הורמון של עניין נקבע באמצעות מקבילות. בעקומת הקבלה, נקודת הכריכה של 50%קובעת את גורם הדילול לדוגמה בעקומה הסטנדרטית. כפי שניתן לראות, תמציות 100%אתנול ו 100%isopropanol לא סיפקו תזוזה מקבילה נגד תקן קורטיזול.
עם זאת, תמצית 100% מתנול מספקת תזוזה מקבילה מול תקן הקורטיזול. מקדמי תוך-הערכה של וריאציה נקבעים מתמציות מדגם גבוהות ונמוכה המנוהלות בכל הראיות. הבקרות הפנימיות הנמוכות נתפסות כבריכת תמצית קואלה מסודרת, ואילו הבקרות הפנימיות המחייבות הגבוהות נתפסות כבריכת תמצית קואלה מדוללת של אחד עד שניים.
הקשר בין כל תמצית ממס ותקן קורטיזול נקבעים לאחר מכן באמצעות עלילת רגרסיה. תמצית 100%מתנול מספקת את השורה הטובה ביותר של רגרסיה עם הערך R בריבוע הגבוה ביותר לעומת תמציות 100%אתנול ו 100%isopropanol. חשוב לזכור כי שלב לשטוף מדגם חייב להתבצע לפני שחיקה את הדגימות, כדי למנוע אובדן של הורמונים סטרואידים.
בעקבות הליך זה, אנו יכולים למדוד הורמונים סטרואידים אחרים, כגון הורמוני הרבייה להסתכל על האינטראקציות בין מתח רבייה קואלות. טכניקה זו מספקת כלי חדש לתחום המתפתח של פיזיולוגיה שימור, המאפשר הערכה לא פולשנית של קורטיזול בפרוות קואלה. ערכת הקורטיזול המסחרית מספקת רייגנטים בכמות דקה.
עם זאת, חשוב ללבוש ציוד מגן אישי כדי למזער את הפגיעה בעצמך בעת ביצוע הליך מעבדה זה.
