Il s’agit d’une nouvelle méthode pour l’évaluation de l’hormone glucocorticoïde, le cortisol, à partir de la fourrure de koala. Il fournit un nouveau biomarqueur pour l’évaluation du stress chronique chez les koalas. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode très sensible et reproductible avec un délai d’exécution assez rapide entre la préparation de l’échantillon et l’essai d’hormones.
Cette technique permet l’évaluation quantitative du stress chronique chez les koalas, qui est un outil de gestion clinique très utile. Dylan Fox, un étudiant diplômé de mon laboratoire, m’aide dans cette procédure. Pour commencer cette procédure, récupérez la fourrure de l’entreposage à moins 80 degrés Celsius et laissez-la décongeler à température ambiante.
Ensuite, pesez la fourrure sur un équilibre de précision analytique de laboratoire. Placer 60 milligrammes de fourrure dans un tube de centrifugeuse prélouté et étiqueté de 1,5 millilitre et répéter jusqu’à ce que 18 tubes soient remplis. À l’aide d’une pipette, ajouter un millilitre d’isopropanol de qualité 100% HPLC à chaque tube.
Vortex les échantillons pendant 30 secondes. Filtrer chaque échantillon à l’aide d’un tamis de micro-précision de 0,5 millilitre afin d’obtenir la séparation du liquide et de la fourrure, et jeter le liquide dans un conteneur à déchets. Placez chaque échantillon de fourrure dans un bateau de pesage en plastique étiqueté.
Placez ensuite les bateaux de pesage dans un dessiccateur sous vide et laissez sécher la fourrure pendant trois jours. Une fois la fourrure complètement sèche, placez chaque échantillon dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre étiqueté. Placer chaque échantillon dans un moulin à perles avec trois perles d’acier chromé et pulvériser pendant deux minutes à 30 secousses par seconde.
Répétez ce transfert avec du méthanol de qualité analytique à 100 % et de l’isopropanol de qualité analytique à 100 % jusqu’à ce que 18 tubes totaux aient été remplis. Après cela, utilisez une pipette pour transférer un millilitre de la première technique d’extraction dans six tubes de centrifugeuse de 1,5 millilitre contenant l’échantillon de fourrure. Capuchon chaque tube, et utiliser un shaker pour les incuber à température ambiante avec pulsation constante pendant au moins 12 heures.
Filtrez ensuite les échantillons à l’aide d’un tamis de micro-précision de 0,5 millilitre. Utilisez une pipette pour transférer le liquide dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre étiqueté, tout en veillant à ce que la fourrure soit jetée de façon appropriée. Dans une hotte de fumée, essayez complètement l’extrait de solvant sous un jet de vapeur d’azote.
Puis, reconstituer l’échantillon séché avec 400 microlitres de tampon d’essai et 100 microlitres d’éthanol de qualité 100% analytique. Pour effectuer les contrôles, sélectionnez d’abord des échantillons d’animaux exposés au stresseur. Pour faire un pool d’extraits, prendre 20 microlitres d’extrait de chaque échantillon jusqu’à ce qu’un volume total de 200 microlitres soit obtenu.
Conserver la piscine d’extrait à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à faire des analyses. Une fois prêt, obtenir le facteur de dilution pour les points de liaison de 30% et 70% du graphique parallélisme pour l’extrait par rapport à la norme cortisol, et utiliser tampon d’essai pour diluer le pool d’échantillons de manière appropriée pour créer les contrôles élevés et bas. À l’aide d’un kit de cortisol commercial, mettre en place une plaque de bande de 96 puits comprenant les échantillons, les contrôles, les normes de cortisol, les puits non contraignants et les puits à liaison maximale selon les instructions du fournisseur.
Utilisez la feuille de mise en page des plaques incluse dans le livret du kit pour énumérer les positions des échantillons, des contrôles et des normes. Ensuite, suivez le processus d’extraction de l’hormone de la fourrure décrit précédemment pour obtenir 100% de fourrure de koala extraite de méthanol. Préparez les réaccentrages du kit de cortisol selon les instructions du fabricant.
Pipette 50 microlitres d’échantillons ou de normes dans les puits de la plaque. Pipette 75 microlitres de tampon d’essai dans les puits non contraignants, et 50 microlitres de tampon d’essai dans les puits à liaison maximale. À l’aide d’une pipette répéteur, ajouter 25 microlitres du cortisol conjugué à chaque puits.
Ensuite, pipette 25 microlitres de l’anticorps cortisol dans chaque puits, à l’exception des puits non spécifiques contraignants. Appuyez doucement sur les côtés de la plaque pour vous assurer que les réhésifs sont bien mélangés. Couvrir la plaque avec le scellant de plaque, et utiliser un shaker orbital pour secouer à température ambiante pendant une heure.
Après cela, retirez le joint de plaque, et aspirez la plaque de puits en lavant chaque puits avec 300 microlitres de tampon de lavage quatre fois. Ensuite, séchez la plaque en la tapant sur des serviettes absorbantes propres. Pipette 100 microlitres de substrat de tétraméthylbenzidine à chaque puits.
Placer le scellant de la plaque sur la plaque de puits et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Après cela, pipette 50 microlitres de solution d’arrêt dans chaque puits. Transférez la plaque dans un lecteur de plaque capable de lire 450 nanomètres, et calculez la concentration finale d’hormone telle que décrite dans le protocole de texte.
Dans cette étude, la détection d’essai des métabolites d’hormone d’intérêt est déterminée utilisant le parallélisme. Sur la courbe du parallélisme, le point de liaison de 50 % détermine le facteur de dilution de l’échantillon sur la courbe standard. Comme on peut le voir, les extraits 100% éthanol et 100% isopropanol n’ont pas fourni de déplacement parallèle par rapport à la norme cortisol.
Cependant, l’extrait de 100% méthanol fournit le déplacement parallèle contre la norme de cortisol. Les coefficients de variation intra-et inter-analyse sont déterminés à partir d’extraits d’échantillons à liaison élevée et basse exécutés dans tous les analyses. Les commandes internes à faible liaison sont considérées comme un pool d’extrait de koala soigné, tandis que les commandes internes à liaison élevée sont considérées comme une à deux piscine diluée d’extrait de koala.
L’association entre chaque extrait de solvant et la norme de cortisol sont alors déterminées à l’aide d’une parcelle de régression. L’extrait de 100% méthanol fournit la meilleure ligne de régression avec la valeur R-carrée la plus élevée par rapport aux extraits 100% éthanol et 100% isopropanol. Il est important de se rappeler que l’étape de lavage de l’échantillon doit être effectuée avant de broyer les échantillons pour éviter la perte d’hormones stéroïdes.
Après cette procédure, nous pouvons mesurer d’autres hormones stéroïdiennes, telles que les hormones de reproduction pour examiner les interactions entre le stress et la reproduction dans les koalas. Cette technique fournit un nouvel outil pour le domaine émergent de la physiologie de conservation, permettant l’évaluation non invasive du cortisol dans la fourrure de koala. Le kit de cortisol commercial fournit des reagents en quantité infite.
Cependant, il est important de porter de l’équipement de protection individuelle pour minimiser les blessures à soi-même tout en effectuant cette procédure de laboratoire.
